败酱草提取物对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织nf-、il-1和il-10的影响

败酱草提取物对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织nf-、il-1和il-10的影响

湿草是指湿科多年生草本植物的黄花湿草和白色总草。具有清热解毒、排脓止痛、活血化瘀、活血化瘀的功效。临床常用于慢性胃炎、胃食管反流、放射性直肠炎、溃疡性结肠炎等。笔者前期药理研究结果显示败酱草可升高UC大鼠SOD值,降低MDA值,降低MPO活性,从而改善或减轻溃疡性结肠炎症状。溃疡性结肠炎的病因及发病机制尚不十分明确,目前研究认为许多细胞因子和相关基因与其关系最为密切。促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ等)与抗炎细胞因子(如IL-10、TGF-β等)水平之间的比例失调目前被视为IBD的一个重要发病机制。本研究在以往研究工作的基础上,进一步观察败酱草对UC大鼠结肠肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和IL-10表达的影响,探讨其对IBD的可能作用机制。1材料和机器1.1药物、试剂和仪器败酱草药材(购自)广州市药材公司,经广东药学院中药学院王凤云老师鉴定为败酱科(Valerianaceae)败酱属(Patrinia)植物黄花败酱(PatriniaScabioscaefoliaFisch)的带根全草。败酱草提取物(自制,含量为1.2g原生药/mL);TNBS由美国Sigma公司生产,批号为090M5000,购自上海Sigma-Aldrich生物技术有限公司;巴柳氮钠片,规格:0.5g/片,山西安特生物制药股份有限公司生产,国药准字H20041706;水合氯醛由天津科密欧化学试剂有限公司生产,批号为20090922;AR级无水乙醇由天津大茂化学试剂有限公司生产,批号为20090318;大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10酶联免疫检测试剂盒为美国BD公司产品,由上海宝生物科技有限公司进口分装。1.2研究动物SD大鼠40只,雌雄各半,体重180～220g,购自广东省医学实验动物中心,合格证号SCXK(粤)2008-0002,试验前适应性饲养1周。1.3荧光生物显微镜成像系统电子分析天平(型号为FA1004)为上海精密科学仪器有限公司;恒温箱(型号:HPX-9052MBE)为上海博迅实业有限公司;RM2135型轮转式切片机、EG1140石蜡包埋机、HI1210摊片机、HI1220烘干机,德国徕卡公司;全自动生化分析仪,意大利ECHO公司;LeicaDMR高级研究型荧光生物显微镜成像系统,德国Leica公司;多功能酶标仪,美国perkinElmer公司;HC-3618R高速冷冻离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;一次性无菌注射器,手术器械等。2方法2.1提取制备生药液制备取败酱草100g,加1000mL蒸馏水浸泡2h后,回流提取2次,合并提取液,浓缩至200mL,过滤,滤液置冰箱中冷藏(0.5g生药/mL)。用研钵将巴柳氮钠片研成细末,用0.5%的羧甲基纤维素钠配成药物浓度为0.1g/mL的溶液。2.2造模和损害是否会是大鼠的模型将40只大鼠随机分成4组,每组10只:正常组、模型组、败酱草组和巴柳氮组,除正常组外,其余各组大鼠禁食不禁水24h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,用大鼠灌胃针管由肛门缓慢插入8cm,模型组、败酱草组、巴柳氮组推入造模溶液(使用50%乙醇0.25mL配成的100mg/kgTNBS),正常组给予同体积生理盐水灌肠,各组大鼠倒立30s后,仰卧放回笼子。灌肠24h后,正常组及模型组灌胃生理盐水10mL/kg·d,败酱草组灌胃败酱草水煎液4mL/kg·d,巴柳氮组灌胃巴柳氮钠水溶液10mL/kg·d(即巴柳氮钠1g/kg,大鼠给药量为成人临床剂量10倍)灌胃,连续10d。2.3样品采集灌胃治疗结束后,禁食24h,颈椎脱臼处死所有大鼠,开腹腔迅速取出结肠,沿纵轴切开,生理盐水迅速冲洗干净,置于10%甲醛溶液中固定。2.4肠组织病理学评价标本固定,常规石蜡包埋,切片、HE染色、光镜观察,参考文献进行组织学评分。2.5elisa法检测bs缓冲液中tnf-、il-1、il-10的水平每只大鼠称取结肠组织200mg,放入试管,再加9倍体积冰冷PBS缓冲液(pH7.4)冰浴匀浆,融冻2次,低温离心机4℃3000r/min离心10min,取上清,采用双抗体夹心ELISA法检测上清TNF-α、IL-1β、IL-10的水平。2.6统计学分析所得数据均以均数±标准差(ˉx±s)表示。采用统计学处理软件spss13.0进行统计学分析,多样本间均数比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA),组间差异比较用LSD-t(方差相齐)、Tamhane’sT2(方差不齐)。3结果3.1低血肉中染正常组大鼠结肠镜下观察组织形态正常,结肠壁各层结构清晰,未见水肿、糜烂及溃疡,间质少量淋巴细胞浸润。模型组大鼠结肠组织可见黏膜层、黏膜下层广泛溃疡形成,中性粒细胞及淋巴细胞浸润,腺体破坏,结构紊乱,杯状细胞减少,隐窝结构扭曲,隐窝炎症及脓肿形成。经药物干预后,败酱草组、巴柳氮组大鼠结肠组织可见病变明显比模型组病轻,溃疡愈合,隐窝脓肿消失,充血水肿明显减轻,炎性细胞浸润明显减少。所有造模组大鼠结肠组织病理学评分显著高于正常组(P<0.01),败酱草组、巴柳氮组较模型组显著下降(P<0.01),但两治疗组间差异无统计学意义(见表1)。3.2统计学处理与正常组相比,模型组大鼠结肠组织促炎细胞因子TNF-α、IL-1、IL-10水平显著升高,有极显著性意义(P<0.01),但两治疗组间的差异无统计学意义。与模型组相比,两治疗组大鼠结肠组织TNF-α、IL-1、IL-10水平显著下降(P<0.01)。两治疗组间的差异无统计学意义(见表1)。与正常组相比,模型组、败酱草组动物的结肠组织IL-10水平显著升高(P<0.01),巴柳氮组无统计学意义。与模型组比较,巴柳氮组大鼠结肠组织IL-10水平显著下降(P<0.01),败酱草组无统计学意义。败酱草组大鼠结肠组织IL-10水平显著高于巴柳氮组(P<0.01,见表1)。4tnf-抑制剂研究发现,与模型组比较,败酱草组大鼠组织病理损伤减轻,效果与阳性巴柳氮钠组类似。TNF-α和IL-1β是UC发病机制中重要的促炎介质:促炎细胞因子IL-lβ可上调免疫因子并促炎症活性;促炎细胞因子TNF-α可使内皮细胞黏附分子水平升高并诱导中性粒细胞聚集。本研究发现,TNBS造模大鼠结肠组织IL-1β和TNF-α表达水平明显升高,败酱草干预后两个促炎细胞因子水平下调。IL-10通过抑制激活的单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和T细胞发挥有效功能。对于TNBS诱导的鼠结肠炎,经巴柳氮或败酱草治疗后,