植物花粉的制备及体外微结构观察

植物花粉的制备及体外微结构观察

植物花粉是植物生长、遗传、变异特性和功能的基础。形状稳定，许多微形状特征明显反映了种间的差异和生存信息。它在遗传和科学研究中具有重要的科学价值。近年来，国内外对物质资源的形态报告主要集中在分类、遗传和相关方面。随着人类保护森林资源和生态环境的认识不断增强，相关科学人员和相关人员越来越重视植物花粉的形态研究。扫描电视图像具有高分辨率高、视觉效果强、图像直观等特点。这是研究花粉形态的好方法。然而，由于对植物花粉的电视图像技术报道较少，因此采用的方法大多是成本低、周期长的样品制备技术，难以获得丰富、准确的植物花粉信息，严重影响植物资源形态的深入研究。同时，它也给人一种将植物丝镜成像技术与之共存的感觉。因此，有必要进一步研究植物花粉的电镜样品制备技术。1材料和机器1.1植物花粉的制备随机采集了4种性能差别较大的植物花粉,分别用不同的样品制备技术进行制备,并使用容易体现形貌特征的放大倍数,在扫描电子显微镜中进行花粉形态和花粉纹饰的观察.在制备过程中发现,不同植物花粉的壁厚和含水量差别很大,概括为3类:壁薄、含水量大的植物花粉;壁稍厚、含水量较小的植物花粉;壁厚、含水量小的植物花粉.其中,只有壁厚、含水量小的植物花粉可以采用直接粘台、真空喷镀或固定后粘台、真空喷镀的样品制备技术.此方法简单易行,可保持好花粉微细形态特征.但此方法不适宜制备壁薄、含水量大的植物花粉;同样也不适用于壁稍厚、含水量较小的植物花粉,否则,只能导致花粉结构变形,使种质资源研究得到错误信息.试验材料于2006年在南京林业大学校园内随机取样,采集杨树(Populus)雄蕊、苦竹(Pleioblastusamarus)雄蕊、萱草(Hemerocallisfulva)雄蕊和鹅掌楸(Liriodendrontulipifera)雄蕊,分别抖出花粉.1.2仪器主要仪器有:日立HCP—2临界点干燥仪;日立IB—5离子溅射仪;菲利蒲SEM—505扫描电子显微镜.2测试方法将杨树、苦竹、萱草和鹅掌楸花粉各分成4份,采用不同的制备技术试验.2.1牛皮纸制造技术和真空喷锡技术将杨树、苦竹、萱草、鹅掌楸花粉分别粘台,离子溅射仪喷镀,扫描电子显微镜观察.2.2电子显微镜观察将杨树、苦竹、萱草、鹅掌楸花粉分别浸入3%戊二醛固定2h以上,0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次,酒精梯度脱水,离子溅射仪喷镀,扫描电子显微镜观察.2.3电子显微镜观察将杨树、苦竹、萱草、鹅掌楸花粉分别浸入3%戊二醛固定2h以上,0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次,浸入醋酸铀导电液1h,0.1mol/L磷酸缓冲液清洗2次,梯度脱水,粘台,离子溅射仪喷镀,扫描电子显微镜观察.2.4电子显微镜观察将杨树、苦竹、萱草、鹅掌楸花粉分别浸入3%戊二醛固定2h以上,0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次,锇酸固定2h,0.1mol/L磷酸缓冲液清洗3次,酒精梯度脱水,醋酸异戊酯置换、临界点干燥,离子溅射仪喷镀,扫描电子显微镜观察.3结果与分析3.1花粉的外观形态及微细结构图1-1,2为杨树和苦竹花粉形态.从图中可见:在高分辨的扫描电镜中其外观形态干瘪,群体花粉结构全部发生了严重变化.图1-3为萱草花粉的外观形态,在高分辨的扫描电镜中,大多数花粉的外观形态保持良好,只有少数花粉的外观形态发生了变化.图1-4为鹅掌楸花粉形态,从图中可见:其外观形态和微细结构均保持良好状态.结果表明:粘台、真空喷镀技术不适用于制作壁薄、含水量大的杨树和苦竹花粉样品;用于壁稍厚、含水量较小的萱草花粉等样品的制备也得不到理想的效果;但适合壁厚、含水量小的鹅掌楸等类似花粉的样品制备.3.2花粉的外观形态及超微结构图1-5,6为杨树花粉、苦竹花粉.从图1-5,6中可见:其形态有变异,但比采用粘台、真空喷镀技术制备的植物花粉样品得到的结果饱满一些.图1-7为萱草花粉的外观形态.在高分辨的扫描电镜中外观形态基本保持良好,但也有少数花粉的外观形态变化.图1-8为鹅掌楸花粉和鹅掌楸花粉纹饰,从图中可见:其外观形态和超微结构均保持良好状态.结果表明:固定、粘台、真空喷镀技术也不适用于壁薄、含水量大的杨树、苦竹花粉及壁稍厚、含水量较小的萱草花粉等样品的制备;但适用于壁厚、含水量小的鹅掌楸花粉样品制备.3.3花粉的表征图1-9～12分别为杨树、苦竹、萱草、鹅掌楸花粉形态,从图中可见:他们在扫描电镜中其外观形态均得到了保持,但分辨率较低,不能在高倍率状态下观察清楚花粉纹饰.结果表明:组织导电制备技术可用于植物花粉样品的低倍观察;但不适用于植物花粉纹饰和突起的超微结构观察.3.4花粉的形态特征图1-13,14为杨树和苦竹花粉形态.从图中可见:其外观形态和超微结构均保持良好状态.图1-15,16为萱草花粉的个体形态和纹饰.不仅外观形态保持良好,纹饰和突起也清晰可见.图1-17,18为鹅掌楸花粉的个体形态和纹饰.其外观形态和超微结构均保持良好状态.结果表明:临界点干燥技术不但能保持植物花粉的活体形态,还可提供丰富的花粉生存信息和微细结构,是进行种质资源形态研究的优秀手段.4植物花粉样品制备的原则(1)直接粘台喷镀和固定后粘台喷镀技术在花粉样品制备中简单易行,周期短,成本低,但不能保持含水量大的花粉微细结构,无法满足于大多数植物花粉的样品制备需求.只适用于极少数壁厚、含水量小的植物花粉样品的制备.(2)杨树、苦竹等花粉的壁薄、含水量大,离开植物机体后,形态迅速发生变化,要保持好样品的原始形态,需将花粉迅速浸入戊二醛固定液中固定,再采用能够消除液体表面张力的样品制备技术,才能保存好花粉的微细结构.(3)植物花粉样品采用组织导电技术制备,可保持良好形态,但分辨率较低,放大倍率4000倍以上时,很难观察清楚植物花粉的纹饰和突起.因此,组织导电技术不能体现植物花粉的生存信息和超微结构,不适用于花粉形态的深入研究.(4)通过临界点干燥技术制备植物花粉,外观形态保持良好,生存信息