三七伤药胶囊中三七总皂苷含量测定方法的建立

三七伤药胶囊中三七总皂苷含量测定方法的建立

三七是三七科的一种植物。它可以缓解血液抑制、肿胀和疼痛。三七总皂苷含有人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1和三七皂苷R1、R2、R3、R4、R6等20余种皂苷成分,均属达玛烷型(Dammaranetype)四环三萜皂苷。其中人参皂苷Rb1(Rb1)、人参皂苷Rg1(Rg1)是三七总皂苷中含量最高的两个成分,而三七皂苷R1(R1)则是三七总皂苷的特征化合物。现代药理研究发现,三七总皂苷的药理活性主要在于改善血液系统和心血管系统功能、滋补强壮、调节免疫等方面,用于急慢性挫伤、扭伤、关节痛、神经痛、跌打损伤等。三七常用于复方中,对三七及其制剂的化学成分分析,成为了评价其药品质量的重要方法。建立三七制剂中三七总皂苷含测方法,为三七总皂苷的定量提供技术依据与参考。三七伤药胶囊处方是由三七、草乌(蒸)、雪上一枝蒿、冰片、骨碎补、红花、接骨木、赤芍组成,其功能主要是舒筋活血,散瘀止痛。三七伤药胶囊法定质量标准中控制三七含量主要是以人参皂苷Rbl及人参皂苷Rg1为指标成分,其方法操作极为繁琐、复杂。故本实验旨在探索研究建立更为简捷的含量测定方法。1药品对照品岛津UV-2450型紫外-可见分光光度计;三七伤药胶囊(市售;批号:20080412,20080616,20081024);对照品:人参皂苷Rg1(中国药品生物制品检定所提供,批号为:110703-200726);试剂:甲醇、正丁醇、NaOH、香草醛、冰醋酸均为分析纯。2方法和结果2.1对照溶液的制备精密称取对照品人参皂苷Rg1适量,置25mL容量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,配制成浓度为0.1026mg/ml的对照品溶液。2.2全波长扫描结果取人参皂苷Rg1对照品溶液(0.1026mg/ml)、样品溶液经香草醛-高氯酸显色后,进行全波长扫描。结果见图1。由全波长扫描结果可知:样品最大吸收波长(550.0nm)与人参皂苷Rg1最大吸收波长(550.0nm)相同。故检测波长选择550.0nm。2.3标准曲线的绘制精密称定适量人参皂苷Rg1加甲醇配制成浓度为0.1010mg/ml的溶液,精密吸取该对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml至10ml容量中,用甲醇稀释至刻度,依上法检测,以吸光度为纵坐标,人参皂苷Rg1的浓度(μg/ml)为横坐标,绘制标准曲线,得回归方程:y=3.57×10-2x+1.66×10-2(r=0.9994)。结果表明,人参皂苷Rg1浓度在5.05～30.30μg范围内具有良好的线性关系。2.4供试品溶液的制备提取溶剂选择水饱和正丁醇。精密称取三七伤药胶囊内容物0.1203g,研细,置250ml具塞锥形瓶中,加50ml水饱和正丁醇密塞,超声处理(功率250W,频率50Hz)30分钟,再转置圆底烧瓶中,加入水饱和正丁醇50mL,电热套加热回流30分钟,趁热过滤至分液漏斗中,用1%NaOH溶液洗涤2次,每次15ml,取正丁醇层挥干溶剂,甲醇转溶到25ml容量瓶,精密量取1ml到具塞试管,水浴挥干溶剂,精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL显色,在(60±1)℃水浴中保温15min,立即置冰水浴中冷却,加入冰醋酸5.0mL摇匀,放置15min,作为供试品溶液。用相应试剂平行进行空白对照试验,用紫外-可见分光光度仪测定吸光度,计算总皂苷含量。2.5供试阴性样品测定按处方中药味比例,配制不含三七的君药,按供试品制备工艺制备成供试阴性样品,再按供试品溶液制备方法制成阴性对照样品,依法测定,结果阴性对照溶液在550.0nm处吸收为0.011,干扰为样品吸光度的2.0%,可忽略不计。2.6测定样品时间取样品供试溶液,按上述方法处理后,做连续时间下紫外扫描,并于1、2、3、4小时各测一次吸光度,结果表明,供试品溶液不稳定,所以需定时测定样品,时间确定为30min内。2.7精密度测试取一份供试溶液,按上述测定方法在550nm波长处重复测6次,结果吸光度的RSD值为0.7%,表明紫外可见分光光度仪精密度良好。2.8重复性试验按2.4项下方法,取同一样品6份,分别制备成供试品溶液,测定吸光度值,计算总皂苷含量,结果总皂苷的相对标准偏差RSD为1.5%,表明该方法重复性良好。2.9加样回收率测定精密称取已知含量的供试品粉末(含量0.0189g/g)约0.075g,平行6份,分别精密加入人参皂苷Rg1对照品0.00138g,依上述方法测定,按下式计算回收率,结果见表1。结果表明回收率良好。2.10加样样品的测定精密称取1项下三批试药样品适量,按2.4项下方法制备成供试液,分别测定其含量,结果三个批号的供试样品中三七总皂苷含量分别为0.0193、0.0189、0.0185g/g,RSD=2.1%,说明供试样品中三七总皂苷含量稳定,生产工艺成熟、稳定、可靠。3讨论3.1碱洗次数的确定由于三七伤药胶囊中含有的黄酮类化合物对三七总皂苷的含量测定干扰比较大,选择碱洗的方法去除干扰,并进行了碱洗次数和用量的考察。理论上碱洗次数越多,用量越大,则去除的黄酮类化合物越多,最后干扰越小,但碱洗去除黄酮类化合物的同时,三七总皂苷也会流失,使回收率下降;碱洗次数越少,用量越少,则三七总皂苷的损失越少,但残留的黄酮类化合物越多,阴性干扰越大。要在阴性干扰与回收率之间取得平衡,实验表明,当碱洗次数为两次(每次15ml)时,阴性干扰比较小而回收率也在95%以上,所以选择碱洗两次(每次15ml)。3.2加样回收率及加样回收率本实验方法阴性干扰为3.1%,人参皂苷Rg1在上述浓度范围内具有良好的线性关系,加样平均回收率为95.9%,RSD为2.3%。证实本方法简便、准确、灵敏度高、重复性好,可作为该制剂中