大鼠肝移植模型建立及急性排斥反应评分的研究

大鼠肝移植模型建立及急性排斥反应评分的研究

0大鼠肝移植急性排斥反应模型肝脏临床移植已作为最有效的治疗肝疾病的手段之一。然而，在肝移植后的临床治疗中仍然存在许多并发症。肝脏移植后的首选药物是长期抗炎药物和药物引起的药物副反应。基本方法是肝移植后的免疫抗虫。研究肝移植免疫耐受的基础动物模型是大鼠肝移植急性排斥反应模型,在该模型的基础上应用各种免疫耐受诱导方法才能获得干扰急性排斥反应的可靠结果。经过30余年的技术改进,目前大鼠肝移植急性排斥反应模型最为成熟的建立方法为kamada二袖套法,国际上公认的鼠种配对方式为DA至Lewis大鼠、DA至BN大鼠及BN至Lewis大鼠,国内由于上述鼠种缺乏及技术操作尚待改善,目前较多应用的鼠种配对方式Wistar至SD大鼠或者Lewis至Wistar大鼠,其实验结果较难获得国际认可。基于上述原因,本研究在大量SD大鼠肝移植模型建立训练的基础上,采用DA大鼠为供体,Lewis大鼠为受体,并辅以围手术期短期饲喂治疗剂量的他克莫司,观察所建大鼠肝移植急性排斥反应模型的稳定性,摸索DA至Lewis大鼠肝移植急排模型建立经验,为后期大鼠肝移植急性排斥反应和免疫耐受诱导研究提供稳定的动物模型。1大鼠肝移植手术设计:按照供受体体质量基本一致的原则,随机选择供受体大鼠进行肝移植模型建立的动物实验。时间及地点:实验于2008-03/2009-12在昆明医学院云南省天然药物重点实验室动物室完成。材料:实验动物:健康、成年、SPF级近交系雄性DA(darkagouti)大鼠60只(购于哈尔滨医科大学实验动物中心),体质量200~250g。健康、成年、SPF级近交系雄性Lewis大鼠60只(购于北京维通利华实验动物公司),体质量250~300g。所有动物在层流动物室普通饲料喂养,室内温度波动于22~25℃。实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。实验器械和试剂:显微外科手术器械(上海医疗器械有限公司);7-0和8-0带针尼龙缝线(上海医用缝合针厂);门静脉和肝下下腔静脉袖套管分别采用6F和8F动脉鞘管(美国Johnson公司)修剪而成,鞘管长10mm,内径分别为2mm与3mm;胆道支撑管使用硬膜外聚乙烯导管修剪而成,内径0.7mm,长10mm;石蜡切片机(德国Leica公司);苏木精-伊红染色相关试剂;APIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统(深圳华海电子有限公司);他克莫司胶囊(日本藤泽药厂);乙醚分析纯(常熟杨圆化工有限公司);大鼠吸入麻醉固定瓶及大鼠乙醚麻醉吸入器(自制)。实验方法:动物模型制作概述:按Kamada“二袖套法”建立大鼠原位肝移植模型,供体为雄性DA大鼠,受体为雄性Lewis大鼠,共建立移植模型60只,于层流动物实验室实施手术,所有动物实验前12h禁食,不禁水,术后受体鼠置于室温控制在24~27℃的层流动物饲养间,单笼恒温饲养,注意保持笼舍清洁,垫料干燥。术后1h后即恢复自由饮食葡萄糖水,24h后恢复进食,术后当天肌注10×104U青霉素,术后不再给予静脉补液,除他克莫司外不使用其他药物。受体大鼠均给予治疗剂量的他克莫司(0.05mg/kg,灌胃,2次/d,连续8d,术前1d开始,术后第8天开始每日半量减药,第13天停止给药)。大鼠肝移植手术详细步骤:手术分为4个部分:麻醉、供体手术、供肝修整及受体手术。麻醉:使用大鼠吸入麻醉固定瓶固定大鼠,进行持续乙醚吸入麻醉约30s,观察大鼠意识丧失,四肢松弛,立即将大鼠仰卧固定于鼠手术台上,将乙醚麻醉吸入器口对准大鼠鼻部,进行持续乙醚吸入麻醉,密切观察大鼠呼吸频率及呼吸动度,保持呼吸频率20~40次/min,呼吸动度有力。麻醉起效后肌注阿托品0.05mg/只,减少大鼠呼吸道分泌物,保持呼吸道通畅。供体手术:取雄性DA大鼠腹部十字大切口进腹后,充分暴露肝脏及腹腔其他器官。用带延长管的5号针头穿刺腹主动脉末端分叉处前壁,针头前端沿腹主动脉管腔到达肾动脉水平,固定穿刺针并阻断下行血流。剪开大鼠胸腔,夹闭胸主动脉,剪开心脏,经腹主动脉插管缓慢推注4℃肝素林格液,5mL/min。肝周及胸腔近膈肌处放置冰屑,保持肝脏低温状态。仔细解剖左膈静脉与腔静脉汇入处,分股5-0丝线单扎左隔静脉汇入处,距离线结3mm处剪断左膈静脉,同法处理食道静脉。距离肝门约5mm处游离肝外胆管,斜行剪开胆总管前壁,插入自制的胆道支撑管,用5-0丝线结扎、固定,离断胆总管。剔去门静脉主干上的附着脂肪,骨骼化门静脉主干,于幽门静脉和门静脉汇合处使用分股5-0丝线结扎幽门静脉,剪断幽门静脉,尽量减小此处结扎线头体积,缩短幽门静脉残端。自脾静脉和肠系膜上静脉汇合处剪断门静脉。游离肝下缘至左肾静脉平面的下腔静脉,充分骨骼化,剪断右肾静脉后方的右肾动脉,以分股5-0丝线结扎切断右肾静脉,尽量减小右肾静脉结扎线头和右肾静脉残端体积。于肝下缘腔静脉后方绕线,5-0丝线一次性结扎右肾上腺静脉及腰静脉,注意结扎后不能缩窄腔静脉管腔。自左肾静脉同腔静脉汇合处剪断下腔静脉,提起肝下缘,剪断肝后韧带。自膈肌环处剪断肝上腔静脉,注意供体肝不保留膈肌环。将供肝移入修肝盘进行供肝修整及袖套管安装。供体手术图片见图1a,b。供肝修整:整个修肝过程始终保证肝脏在4℃肝素林格液完全浸泡状态下进行。用弯血管钳尖端夹持门静脉袖套管柄,橡皮泥固定血管钳柄部,保持袖套管柄的长轴方向与供肝腔静脉右侧壁的长轴方向一致,用微血管镊穿过自制袖套管管腔,夹住门静脉端外翻于套管外壁,最好将幽门静脉的结扎处翻于套管外壁,5-0丝线在袖套管上结扎。同法放置肝下下腔静脉袖套管。在肝上下腔静脉孔的两角用7-0的带针线各缝一针牵引线。用4℃肝素林格液10mL以软质的留置针外套管插入门静脉(注意勿引入气泡)再次灌洗供肝,驱除供肝内的残余血细胞。修剪好的肝脏继续在4℃肝素林格液中保存备用,保存时间不超过1h。供肝修整图片见图1c。受体手术:受体自身肝切除:腹部及胸部剪毛,碘伏消毒术野,取腹部正中大切口进腹,使用自制拉钩分别从左右肋弓和中腹部向两侧牵拉,大鼠腰部垫高约0.5cm,充分暴露肝脏。切断镰状韧带及左三角韧带后,游离盘状乳头叶,仔细解剖左膈静脉与腔静脉汇入处,分股5-0丝线距左隔静脉汇入处约3mm单扎左膈静脉,暂不剪断左膈静脉,同法处理食道静脉。游离肝固有动脉,结扎并剪断。紧贴肝门处游离肝外胆管,在左右肝管汇合处上方约3mm结扎并剪断左右肝管。将肝总动脉及胃十二指肠动脉从门静脉后方仔细剥离约0.5cm,将门静脉游离至幽门静脉水平。游离肝下缘至右肾静脉平面的下腔静脉,于肝下缘腔静脉后方绕线,5-0丝线一次性结扎右肾上腺静脉及腰静脉,注意结扎后不能缩窄腔静脉管腔。切断肝后韧带。加深麻醉后撤除麻醉吸入器,用血管夹夹于右肾静脉上方阻断下腔静脉,于幽门静脉水平阻断门静脉,在近肝门处穿刺门静脉,以30~35℃温生理盐水2.0~3.0mL缓慢灌洗肝脏约0.5min,即可达驱除肝内血,自身输血的目的。以弯头微血管止血钳置于隔肌环以上约0.2cm处,钳夹阻断肝上下腔静脉,大鼠无肝期计时开始。紧贴肝脏剪断肝上下腔静脉和左膈静脉,同法剪断食道静脉,于门静脉左右支分叉处剪断门静脉,距肝脏下缘约0.5cm处剪断肝组织及其内包裹的腔静脉,保留受体侧少许肝下缘肝组织,保证肾上腺静脉及此处的腰静脉与该处肝组织相连。供肝植入:将供肝从4℃的冰浴中取出,原位放入肝脏腔隙内,将供肝右侧7-0血管缝线与受者肝上下腔静脉右侧角缝合,打结,供肝左侧7-0血管缝线由助手牵引。充分暴露肝上腔静脉后壁,然后自右向左连续腔内缝合腔静脉后壁,受体侧连同隔肌环一并缝合,针距和边距均控制在1mm,尽量保持缝合处腔内光滑。当后壁缝合至静脉左侧角时,将缝针从受体侧腔内穿出,转为前壁自左向右连续外翻缝合,此时将左侧的牵引线打结,前壁缝合时受体侧尽量不要缝合膈肌环,针距和边距仍控制在1mm,缝到最后两针时向腔内注入肝素林格液1.0~2.0mL,排出腔内空气,缝合前壁至右侧角时与原有线尾打结,完成肝上下腔静脉吻合。从门静脉袖套管内用软针头注入生理盐水2.0~3.0mL,驱除肝内的肝素林格液及残余气体。将阻断受体门静脉的血管夹下移至幽门静脉水平,排出门静脉内凝血块,肝素林格液1mL冲洗供受体血管腔,迅速套入供者门静脉袖套管,在袖套管上用5-0丝线牢固结扎,移去门静脉血管夹,开放入肝血流,充盈肝脏3~5s,肝下腔静脉袖套管口有血液流出时用血管夹夹闭供肝肝下下腔静脉,松开肝上下腔静脉阻断钳,供肝恢复血流,结束无肝期。将受者肝下下腔静脉微血管夹下移至右肾静脉处,排出腔内血凝块,肝素生理盐水冲洗腔静脉管腔后立即套入供肝肝下腔静脉袖套管,5-0丝线结扎牢靠固定。30mL预热35~40℃生理盐水冲洗腹腔,进行肝脏复温。提起受体左右肝管残端,于分叉处剪开1mm开口,将胆总管支撑管套入受者胆总管管腔内,5-0丝线结扎,并与供体端预留线尾打结,确保支撑管不会脱落。大网膜覆盖供肝胆总管,固定。仔细检查腹腔内有无出血,严密止血处理。显露右下腹腹后壁上的腰静脉,观察此处腰静脉的管径约2mm,远端用7-0无创线缝闭,近端预置7-0无创线,距离该静脉与下腔静脉汇入处约1cm的位置,5号针头穿刺该静脉,并缓慢推注2.0~3.0mL5%碳酸氢钠液,用以纠正无肝期所致的酸中毒,注射完毕,缝扎该静脉。5mL甲硝唑液,2×104U庆大霉素液冲洗腹腔,2-0丝线全层缝合腹壁,关腹。松开四肢固定夹,大鼠即可翻身活动。受体手术及供肝植入图片见图1d~f。主要观察指标:(1)移植术中观察供肝热缺血时间、冷缺血时间、供体手术时间、供肝修整时间、受体手术时间、无肝期时间。(2)移植术后受体大鼠生存时间满24h视为手术成功,计算手术成功率。计算移植术后1周的受体生存率。(3)移植术后观察大鼠的生存期,计算术后生存时间时剔除了大鼠生存状态良好时人为处死大鼠的生存数据,只将手术7d后自发死亡或者濒临死亡时人为处死的大鼠纳入计算。(4)移植术后7,14,21,28d按时点在乙醚吸入麻醉下处死大鼠切取移植肝脏,各时点处死活力较强大鼠数量小于10只,在两时点间因濒临死亡而处死大鼠所获取的标本计入后时点,自然死亡大鼠不进行标本切取处理,每个时点标本数量不少于10个。标本切取前进行在体大体标本病理观察,获取的肝脏标本迅速放入体积分数为10%的中性甲醛液中固定保存,后期统一进行石蜡包埋切片,苏木精-伊红染色,显微镜下观察病理变化并进行急性排斥反应指数评分,彩色图文报告系统摄像存图。(5)肝移植急性排斥反应的判断标准参照国际移植学会1997年在加拿大的Banff举行的会议上制定的肝移植急性排斥反应病理诊断标准,即Banff方案,其中排斥活动指数(rejectionactivityindex,RAI)是根据汇管区、胆管和静脉内皮炎症损伤的轻、中和重度来评分,总分为9分,美国匹兹堡大学医学院Starzl器官移植研究所将RAI0~2分定为无排斥,3分为交界性改变,4~5分为轻度排斥,6~7分为中度排斥,8~9分为重度排斥。由病理科专业医生进行读片和判断,将术后每个时间点获取的病理评分取平均值。设计、实施、评估者:实验设计为第二作者,资料收集、实施为第一、四、五、六、七、八作者,评估为第三作者,采用盲法进行评估。统计学分析:采用SPSS15.0软件进行统计处理,计量资料的比较采用方差分析、计数资料的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有显著性意义。2结果2.1原位肝移植手术成功率及时间关系表1,2,5,10.课题组前期100例SD至SD大鼠原位肝移植定型手术中[10,11,12,13,14,15,16],供肝热缺血时间0min,冷缺血时间40~70min,供体手术时间(20.5±4.0)min,供肝修整时间(8±3)min,受体手术时间(40.0±10.5)min,无肝期为(13.4±3.0)min,手术成功率为97.3%,1周存活率为92.5%。本实验60例DA至Lewis大鼠原位肝移植手术中,供肝热缺血时间0min,冷缺血时间30~60min,供体手术时间(18.5±4.0)min,供肝修整时间(7±3)min,受体手术时间(35.0±7.3)min,无肝期为(13.0±3.0)min,手术成功率为98%,1周存活率为91.6%。与课题组前期肝移植模型建立训练及文献报道的SD大鼠二袖套法肝移植模型训练时间比较[10,11,12,13,14,15,16],发现DA至Lewis大鼠的术中主要操作步骤时间均有不同程度缩短,受体手术成功率两者差异无显著性意义(P>0.05),因为术后饲喂治疗剂量的他克莫司1周,Lewis受体大鼠术后1周存活率与SD受体大鼠比较差异无显著性意义(P>0.05)。2.2术后大鼠的正常饮食及活动受体Lewis大鼠均于肝移植术后0~2min清醒,自动翻身并爬行,10~15min后可自主饮水,术后8~12h可进食面包,术后1d可进食普通鼠粮。由于术后1周内正常剂量饲喂他克莫司,除了极少数出现腹腔渗血、腹腔感染导致术后早期死亡外,其余受体大鼠均能正常饮食及活动。术后8d开始他克莫司半量递减,受体大鼠多于术后10~16d逐渐出现耳廓、足掌及尾巴皮肤黄染及尿色深黄,精神萎靡,毛发蓬乱无光泽,呼吸急促、进食及活动减少,体质量持续下降,多于术后20~30d死亡,处死前肝脏颜色不均,缺血、出血及充血灶并存,肿胀明显,质地变硬,右侧胸腔及腹腔多见少量积液。采用他克莫司短期治疗并撤药的方案后,移植后大鼠的中位生存期为21d,平均生存时间为(20.85±0.71)d。2.3急性排斥反应由图2可见术后7d移植肝脏基本正常,RAI=1.9±0.2,术后第14天逐渐出现肝细胞变性浊肿,肝血窦扩张、充血,汇管区及中央静脉周围出现以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润,部分小胆管周围有淋巴细胞及中性粒细胞浸润,汇管区周围有小灶状的肝细胞坏死,RAI评分平均为3.7±0.9,随着术后时间的延长,急性排斥反应的病理表现变得典型和严重,主要为血管内皮细胞肿胀,汇管区及中央静脉周围大量淋巴细胞浸润,胆管上皮细胞肿胀变形,肝细胞弥漫性肿胀,可见大片状坏死,术后21d与术后28dRAI评分分别达到6.3±0.9和8.1±0.7。3da至lewis大鼠肝移植模型建立前训练二袖套法大鼠肝移植已成为大鼠肝移植的标准术式,被广泛应用于肝移植的基础研究。大鼠原位肝移植手术难度大,技巧性高,术者需要大量的时间进行专门的训练方可建立稳定的大鼠肝移植模型。在进行DA至Lewis大鼠肝移植模型建立前,课题组先采用大量的SD至SD大鼠进行肝移植模型建立训练,根据DA和Lewis大鼠的特点,本实验对部分技术环节进行了改良,取得了较好结果。具体将实验所获取的经验讨论如下。3.1da至男性lewis大鼠肝移植手术成功的部分经验国际公认的大鼠肝移植急性排斥反应模型的经典鼠种是DA大鼠作为供体,Lewis大鼠作为受体,目前国内较少使用这两种大鼠进行原位肝移植模型的建立,原因可能在于:(1)这两种大鼠售价高,实验成本上升。(2)这两种大鼠均为近交系大鼠,对大型手术打击的耐受能力明显低于封闭群大鼠(如SD大鼠)。(3)大鼠肝移植模型建立的技术难度大,需要经长期大量的反复训练,该技术掌握的熟练程度较国外尚有差距。根据实验的自身特点,要求使用雄性DA至雄性Lewis大鼠进行肝移植模型建立,这就对大鼠肝移植模型的建立提出了挑战,因此课题组使用了多达100对的SD大鼠进行肝移植训练,在熟练掌握该技术的基础上,又采用20对DA至Lewis大鼠肝移植手术来摸索近交系大鼠移植模型建立的特点,通过大量的训练方可建立稳定的雄性DA至雄性Lewis大鼠肝移植模型,为后期实验的顺利进行奠定基础。从该移植模型获得的部分经验是:(1)供受体体质量选择需合理,作为供体,雄性DA大鼠的体质量最好限定在200~250g,低于200g的雄性DA大鼠出入肝管道过细,操作困难,高于250g的雄性DA大鼠脂肪肝的发生率高,易出现移植肝无功能,受体雄性Lewis大鼠的体质量限定于250~300g,该体质量区段的雄性Lewis大鼠活力强,对大手术打击的耐受能力较好。(2)严密监测受体大鼠的麻醉深度,由于近交系大鼠的活力较差,在无肝期特别易出现麻醉加深,抢救成功率低,必须保证无肝期大鼠的呼吸及心跳有力。(3)缩短受体手术时间,特别是无肝期时间是手术成功的关键,作者体会到雌性Lewis大鼠对无肝期的耐受能力明显低于SD大鼠,无肝期超过18min,全手术时间超过1h,大鼠术后很难长期存活,经过大量训练我们的受体手术时间(35.0±7.3)min,无肝期为(13.0±3.0)min,手术成功率为98%,1周存活率为91.6%。(4)术中补液纠酸,术后复温明显影响雌性Lewis受体大鼠的存活。3.2灌注的总量控制正是因为DA和Lewis大鼠属于近交系大鼠,活力差,对手术打击的耐受能力差,要建立稳定的移植模型就必须在封闭群大鼠移植模型建立的技术基础上有所改进,除了必备的熟练显微血管缝合技术以外,还要对供肝灌注、保存、减少术中失血及术中补液方式进行改良。正确的原位供肝灌注:供肝灌注的首要任务是保证灌注的均一性和彻底性,这一点在近交系大鼠肝移植术后保持良好的肝功尤为重要。模型建立的初期,发现即使轻微的原位供肝翻动,都会压迫局部肝组织而造成机械性损伤和微血栓形成,使得供肝灌注不良,供肝移植血液复流后可发现供肝局灶性出血和灌注不佳,影响移植成功率。实验中为了充分暴露视野,将腹部十字切口的横切口向两侧延伸至大鼠的腋后线,获得肝脏及腹后壁血管的充分暴露。先进行腹主动脉穿刺插管,剪破心脏放血,做到不翻动肝脏就可以进行肝脏双重灌注,对肝脏迅速降温处理,热缺血时间基本为0,供肝灌注完毕后才进行供肝的操作,一般会看到供肝灌注均匀,质地柔软。供肝灌注时一般采用手动推注进行,但须掌握推注压力,本实验采用5号针头穿刺腹主动脉进行灌注,本身就由于针头内径较细对灌注的流速和压力客观上进行了控制,保证以不大于5mL/min的速度匀速灌注,灌注的总量不需刻意控制,只要达到肝脏变为均匀的土黄色即可,一般正确灌注5~10mL灌注液即可完成肝脏的灌注。左膈静脉、肾上腺静脉及腰静脉的正确处理经验:在移植模型建立的初期训练阶段,导致大多数的受体术中及术后短期内死亡的主要原因是腹腔出血,当然肝上腔静脉吻合口出血是最主要因素,但左膈静脉出血和肾上腺静脉出血以及肾上腺静脉水平的腰静脉出血也不容忽视,得益于临床肝移植的长期训练,血管显微吻合技术得到保证,肝上腔静脉吻合口出血发生概率低,相应其他3处静脉的出血成了模型建立初期阶段受体大鼠短期内死亡的主要原因。开始时,对受体的左膈静脉也采取两侧结扎、中间剪断的方法,但随着对大鼠肝脏的翻动,此处的结扎线头极易脱落,造成大鼠术中死亡,后来在受体大鼠自身肝切除的过程中采用单扎左膈静脉,出入肝血流阻断后切肝时才剪断该静脉的做法,将因左膈静脉出血引起受体大鼠术中死亡的发生率降低为0。在肝下下腔静脉袖套吻合的过程中经常发现吻合后该处的腹后壁易发生出血,经过仔细解剖此处的腔静脉后壁,作者发现有一两支管径约0.5mm的腰静脉在此处汇入腔静脉,在供受体操作的过程中,对此处采用了经腔静脉后一次性结扎右肾上腺静脉和腰静脉的改良术式,简化了手术步骤,降低了该处出血的发生率。受体空气栓塞预防的重要性:在完成50例SD大鼠肝移植模型建立训练手术后,仍时有发现大鼠的不明原因术后2h内死亡,通过尸检发现大鼠左心室有少量泡沫状气体,考虑供肝内少量的残余气体随血流进入左心室引起左室输出量持续减少,导致大鼠短期内死亡。因此除了常规肝上腔静脉吻合完成前腔内注液排气外,在门静脉套管前,从门静脉袖套管管腔内注入2.0~3.0mL生理盐水,一方面再次驱除肝内残余气体,一方面驱除肝内富含肝素的灌注液,有利于大鼠移植后凝血功能恢复,减少吻合口出血机会。在开放门静脉后,暂不同时开放肝上腔静脉,等待少量血液及肝内残余气体从供体肝下腔静脉排出,立即使用血管夹夹闭肝下腔静脉开口,阻止出血和腔静脉气栓产生,随后开放肝上腔静脉,彻底预防移植后气栓的产生,并减少由肝脏内低温血液突然回心引起心跳骤停的发生率。补液成分及途径选择的重要性:肝移植的创伤大,手术时间长,大鼠失血1.0~2.0mL即可出现失血性休克,近交系大鼠对术中失血的耐受能力更差,因此适当的补液对于顺利度过围手术期很重要。在切除受体肝脏前应于门静脉内注入生理盐水2mL驱血,实现“自体输血”,达到补充血容量的目的。在肝下下腔静脉袖套吻合完成后,迅速静脉推注含碳酸氢钠的盐水2.0~3.0mL,可以及时纠正高钾、酸中毒状态,改善微循环,有效防止血栓形成,对于术后的血液动力学稳定非常重要。在实验中发现肝移植手术结束前,由于大鼠经受重大手术打击,往往外周静脉塌陷,经尾静脉补液操作存在困难,术后经阴茎背静脉补液容易引起该处岀血,肝移植手术完毕时受体大鼠凝血功能差,使用阴茎背静脉局部压迫较难止血,且此处又不宜缝扎止血,处理该处静脉穿刺点岀血往往会影响受体大鼠术后的及时恢复。从右下腹后壁腰静脉补液在实际操作中可行,此处的腰静脉因与下腔静脉直接相通,通常充盈好,内径可达1.0~2.0mm,可穿刺长度达2.0~3.0cm,作者采用先缝扎静脉的远心端,再在预定穿刺点的近心端预先缝一针,暂不打结,待穿刺补液完成后再迅速结扎,操作熟练后可有效控制穿刺点出血,完成术中补液。作者体会到无肝期结束后补液纠酸极为重要,补液充分到位的大鼠可见呼吸加快,肝脏颜色由暗红转为鲜红,肠管血管搏动有力,肠管颜色红润,胆汁分泌旺盛。3.3急性排斥反应的应用在建立