选修三 基因工程

＊高考再现＊

（2012浙江）天然的玫瑰没有蓝色花，这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B，而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰，下列操作正确的是（）A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得互补的DNA，再扩增基因BB.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因BC.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞D.将基因B直接导入大肠杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞A（2011年安徽卷）家蚕细胞具有高效表达外源基因能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可以提取干扰素用于制药。(1)进行转基因操作前，需用___________酶短时处理幼蚕组织，以便获得单个细胞。(2)为使干扰素基因在家蚕细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入表达载体的_______________和_______________之间。(3)采用PCR技术可验证干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。改PCR反应体系的主要成分应该包含：扩增缓冲液（含Mg2+）、水，4种脱氧核糖苷酸、模板DNA、______

和____________________________________________________________

。

(4)利用生物反应器培养家蚕细胞时，细胞会产生接触抑制。通常将多孔的中空薄壁小玻璃珠放入反应器中，这样可以_________________增加培养的细胞数量，也有利于空气交换。

答案：（1）胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）（2）启动子终止子（3）TaqDNA聚合酶对干扰素基因特异性的DNA引物对（4）增大细胞贴壁生长的附着面积（11年广东卷）登革热病毒感染蚊子后，可在蚊子唾液腺中大量繁殖，蚊子在叮咬人时将病毒传染给人，可引起病人发热、出血甚至休克。科学家用以下方法控制病毒的传播。（1）将S基因转入蚊子体内，使蚊子的唾液腺细胞大量表达S蛋白，该蛋白可以抑制登革热病毒的复制。为了获得转基因蚊子，需要将携带S基因的载体导入蚊子的

细胞。如果转基因成功，在转基因蚊子体内可检测出

、

和

。答案：（1）受精卵S基因、由S基因转录的mRNA、S蛋白（11年海南卷）回答有关基因工程的问题：（1）构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割DNA后，可能产生粘性末端，也可能产生____末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_____（相同，不同）粘性末端的限制酶。（2）利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是

。

在用表达载体转化大肠杆菌时，常用

处理大肠杆菌，以利于表达载体进入：为了检测胰岛素基因是否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为

。

为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成

，常用抗原-抗体杂交技术。

如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的

中，然后用该农杆菌感染植物细胞，通过DNA重组将目的基因插入植物细胞的_

上。答案：（1）平相同（2）提供RNA聚合酶特异性识别结合位点，驱动基因转录Ca2+

DNA—RNA分子杂交胰岛素原（蛋白质）T—DNA染色体（2012全国新课标T40,15分）根据基因工程的有关知识，回答下列问题：（１）限制性内切酶切割ＤＮＡ分子后产生的片段，其末端类型有

和

。（２）某运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：

G……CTTAAAATTC……G为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是

。（３）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即

DNA连接酶和

DNA连接酶。（４）反转录作用的模板是

，产物是

。若要在体外获得大量反转录产物，常采用

技术。（５）基因工程中除质粒外，

和

也可作为运载体。（６）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是

。答案：（1）黏性末端平末端（2）能识别EcoRI识别的核苷酸序列，并且断开与EcoRI断开相同的两个核苷酸之间的磷酸二酯键（3）E·coliT4（4）RNADNAPCR（5）λ噬菌体的衍生物动植物病毒等（6）需要用Ca2+处理，使大肠杆菌处于感受态才能吸收周围环境中的DNA选修3核心知识关系生态工程原理生态工程实例生态工程生态工程建设基因工程的诞生蛋白质工程基因工程应用基因工程的原理及技术基因工程现代生物科技专题植物的组织培养动物细胞培养体细胞克隆细胞融合与单克隆抗体细胞工程转基因生物的安全性生物技术中的伦理问题生物武器对人类的威胁胚胎工程应用胚胎工程理论基础动物胚胎发育胚胎干细胞移植胚胎工程基因工程基本工具操作程序限制性核酸内切酶DNA连接酶载体分类作用常用载体载体条件其他载体目的基因的获取从基因文库中获取人工合成利用PCR技术扩增基因组文库cDNA文库原理大致过程基因表达载体的构建目的组成及作用目的基因导入受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞农抗菌转化法其他方法显微注射技术Ca2+处理目的基因的检测与鉴定分子水平的检测个体生物水平的鉴定应用转基因植物转基因动物基因工程药物基因治疗抗虫转基因植物抗病转基因植物抗逆转基因植物改良植物品质提高动物生长速度改善畜产品质量生产药物做器官移植供体基因诊断蛋白质工程概念原理应用来源作用结果II

II

II

I一、基因工程的概念及基本工具1.基因工程的概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外

和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和

。2.基因工程的基本操作工具(1)限制性核酸内切酶：又称“分子手术刀”，主要从

中分离，其作用是识别双链DNA分子的某种

，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的

断开。DNA重组生物产品原核生物特定核苷酸序列磷酸二酯键(2)DNA连接酶：又称“分子缝合针”，其作用是

。(3)载体：基因工程中的载体种类有

(常用)、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒，其作用是将

转移到宿主细胞内，并进行大量复制。目的基因将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子质粒二、基因工程的基本操作程序1.获得目的基因(目的基因的获取)(1)方法：从

中获取；人工合成。(2)人工合成的方法：

法和

法。(3)目的基因的扩增方法：

。基因文库反转录化学合成PCR技术2.基因表达载体的构建(1)基因表达载体的组成：除目的基因外，还必须有

、

和标记基因。(2)标记基因的作用：鉴定受体细胞中是否含有

，从而将

筛选出来。启动子终止子目的基因含有目的基因的细胞(3)构建过程：DNA连接同一种限制酶3.将目的基因导入受体细胞

(1)将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是

法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。(2)将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是

，此方法的受体细胞多是

。(3)将目的基因导入微生物细胞：以原核生物作为受体细胞的原因是

快、多为单细胞、遗传物质相对较少；农杆菌转化显微注射技术受精卵繁殖最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是先用

处理细胞，使其成为

细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与该状态细胞混合，在一定的温度下促进该状态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。4.目的基因的检测和表达(1)首先要检测转基因生物的

上是否插入了目的基因，方法是采用

。Ca2+感受态染色体DNADNA分子杂交技术(3)最后检测

，方法是从转基因生物中提取

，用相应的

进行

。(4)有时还需进行

的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现

。抗虫性状目的基因是否翻译成蛋白质蛋白质抗体抗原—抗体杂交个体生物学水平(2)其次还要检测目的基因是否转录出了

，方法是采用

。标记的目的基因作探针与mRNA杂交mRNA1.目的：生产符合人们生活需要的，并非自然界已存在的

。2.目标：根据人们对

的特定需求对蛋白质进行分子设计。3.过程：预期蛋白质功能→设计

结构→推测应有的

序列→找到相对应的

序列（基因）。三、蛋白质工程脱氧核苷酸蛋白质蛋白质功能预期的蛋白质氨基酸＊典例精析＊【解析】本题考查基因工程的有关知识。基因工程的一般过程:①用限制性核酸内切酶切割含目的基因的DNA分子(除草剂基因)和载体(质粒)；②用DNA连接酶连接切割好的目的基因和载体；③重组DNA分子导入受体细胞,因为是植物，可以说是原生质体；④用相应的试剂和病原体筛选转基因细胞；⑤用植物组织培养技术培养抗除草剂的转基因烟草(表达)，所以答案是A。考查目标1基因工程操作的步骤【例1】［2010年浙江理综卷］在用基因工程技术构建抗除草剂的转基因烟草过程中，下列操作错误的是()A.用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸B.用DNA连接酶连接经切割的抗除草剂基因和载体C.将重组DNA分子导入烟草原生质体D.用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞A＊典例精析＊考查目标2基因工程的工具【例2】［2010年江苏高考题］下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图甲、乙中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：（1）一个图甲所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有

个游离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越

。（3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。（4）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒，外源DNA的优点在于可以防止

。（5）为了获取重组质粒，需将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入

酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了

。（7）为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在

的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。以蔗糖为唯一含碳0、2高SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因、外源DNA中的目的基因质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化DNA连接鉴别和筛选含有目的基因的细胞营养物质【解析】本题考查基因工程中限制性内切酶的作用特点。（1）质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故不含游离的磷酸基团。从图甲可以看出，质粒上只含有一个SmaⅠ切点，因此被该酶切割后质粒变为线性双链DNA分子。因为每条链上含有一个游离的磷酸基团，所以切割后含有两个游离的磷酸基团。（2）由题目可知，SmaⅠ识别的DNA序列只有G和C，而G和C之间可以形成三个氢键，A和T之间可以形成两个氢键，所以SmaⅠ酶切位点越多，热稳定性越高。（3）质粒抗生素的抗性基因为标记基因，由图甲、乙可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有SmaⅠ酶切位点，都可以被SmaⅠ破坏，故不能使用该酶剪切含有目的基因的DNA。（4）只使用EcoRⅠ，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用连接酶连接时会产生质粒和目的基因自身连接物，而利用BamHⅠ和HindⅢ剪切时，质粒和目的基因两端的黏性末端不同，用DNA连接酶连接时不会产生自身连接物。（5）质粒和目的基因连接后获得重组质粒，该过程需要连接酶作用，故混合后加入DNA连接酶。（6）质粒上的抗性基因为标记基因，用于鉴别和筛选含有重组质粒的受体细胞。（7）将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，含有重组质粒的个体才能吸收蔗糖，因此可利用蔗糖作为唯一碳源的培养基进行培养，含有重组质粒的细胞才能存活，不含有重组质粒的因不能获得碳源而死亡，从而达到筛选目的。深度突破（1）质粒切割前是双链环状DNA分子，所有磷酸基团参与形成磷酸二酯键，故

含游离的磷酸基团。从图甲可以看出，质粒上只含有一个SmaⅠ的切点，因此被该酶切割后，质粒变为线性双链DNA分子。因为每条链上含有一个游离的磷酸基团，所以切割后含有

个游离的磷酸基团。（2）由题目可知，SmaⅠ识别的DNA序列只有G和C，而G和C之间可以形成

个氢键，A和T之间可以形成

个氢键，所以SmaⅠ酶切位点越多，热稳定性越高。（3）质粒抗生素抗性基因为

基因，由图甲、乙可知，标记基因和外源DNA目的基因中均含有

酶切位点，都可以被SmaⅠ破坏，故不能使用该酶剪切含有目的基因的DNA。（4）只使用EcoRⅠ，则质粒和目的基因两端的黏性末端相同，用连接酶连接时会产生质粒和目的基因

连接物，而利用BamHⅠ和HindⅢ剪切时，质粒和目的基因两端的黏性末端

，用DNA连接酶连接时不会产生自身连接物。不2三两标记SmaⅠ自身不同（5）质粒和目的基因连接后获得重组质粒过程中，需要

酶作用。（6）质粒上的抗性基因为标记基因，用于鉴别和筛选含有

的受体细胞。（7）将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，含有重组质粒的个体才能吸收蔗糖，因此可利用蔗糖作为唯一碳源的培养基进行培养，含有重组质粒的细胞才能

，不含有重组质粒的因不能获得碳源而

，从而达到筛选的目的。DNA连接目的基因存活死亡（2012江苏T13，2分）下列关于转基因生物安全性的叙述，错误的是（）A.种植转基因作物应与传统农业种植区隔离B.转基因作物被动物食用后，目的基因会转入动物体细胞中C.种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性D.转基因植物的目的基因可能转入根际微生物B

（2012山东T35，8分）毛角蛋白Ⅱ型中间丝（KIFⅡ）基因与绒山羊的羊绒质量密切相关。获得转KIFⅡ基因的高绒质绒山羊的简单流程如图。KIFⅡ基因羊胎儿皮肤组织块成年母绒山羊导入目的基因的细胞卵（母）细胞成纤维细胞重组表达载体转基因绒山羊代孕母羊早期胚胎重组细胞③②①（1）过程①中最常用的运载工具是_______，所需要的酶是限制酶和____________。（2）在过程②中，用________处理将皮肤组织块分散成单个成纤维细胞。在培养过程中，将成纤维细胞置于5％CO2的气体环境中，CO2的作用是_________。（3）在过程③中，用_______处理以获取更多的卵（母）细胞。成熟卵（母）细胞在核移植前需要进行________处理。（4）从重组细胞到早期胚胎过程中所用的胚胎工程技术是_________。在胚胎移植前，通过_______技术可获得较多胚胎。答案:（1）质粒DNA连接酶（2）胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）维持培养基（液）的pH（3）促性腺激素（或促滤泡素、孕马血清）去核（4）（早期）胚胎培养胚胎分割1.［2010年江苏高考题］下列关于利用胚胎工程技术繁殖优质奶羊的叙述，错误的是（）A.对受体母羊与供体母羊进行同期发情处理B.人工授精后的一定时间内，收集供体原肠胚用于胚胎分割C.利用胚胎分割技术可以获得两个基因型完全相同的胚胎D.一次给受体母羊移入多个胚胎可增加双胞胎和多胞胎的比例B2.［2010年全国理综Ⅱ］下列叙述符合基因工程概念的是（）A.B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C.用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上B3.［2010年江苏高考题］下列关于转基因植物的叙述，正确的是（）A.转入到油菜的抗除草剂基因，可能通过花粉传入环境中B.转抗虫基因的植物不会导致昆虫群体抗性基因频率增加C.动物的生长激素基因转入植物后不能表达D.如转基因植物的外源基因来源于自然界，则不存在安全性问题4.［2010年江苏高考题］明党参是我国的珍稀药用植物，对其进行保护性开发利用的方