第十一章 动物基因工程

第十一章动物基因工程河南科技大学1

第一节基因工程概述

理论上的三大发现DNA为遗传物质：Avery的肺炎双球菌转化实验DNA双螺旋结构的发现和DNA半保留复制机制遗传密码与中心法则河南科技大学2技术上的三大发明

1.限制性内切酶和连接酶：DNA的“手术刀”与“缝纫机”

2.载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒等

3.逆转录酶：从mRNA到DNA，使真核基因制备成为可能

河南科技大学3河南科技大学4河南科技大学5河南科技大学6河南科技大学7河南科技大学8河南科技大学9河南科技大学10河南科技大学113、基因工程的内容目的基因的获得目的基因与载体的连接成重组DNA分子重组DNA分子导入受体细胞筛选重组克隆基因表达与产物分离河南科技大学12基因操作中的工具酶手术刀－限制性核酸内切酶、核酸外切酶缝纫机－连接酶复印机－DNA聚合酶、逆转录酶第二节基因操作中的工具酶河南科技大学13第三节基因工程的载体

将外源DNA或基因携带入宿主细胞（hostcell）的工具称为载体。一、基因工程载体的概念：河南科技大学14二、基因工程载体的分类：

基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增、传代乃至表达。目前已构建应用的基因工程载体主要有质粒载体噬菌体载体病毒载体人工构建的组合载体河南科技大学15一、细菌质粒载体质粒介绍：

质粒(plasmid)是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，一个质粒就是一个DNA分子，其大小可从1kb到300kb。质粒广泛存在于细菌之中，在某些蓝藻、绿藻和真菌细胞中也存在质粒。质粒DNA的特点为：（1）双链环状；（2）分子量很小；（3）自主或半自主复制；（4）不同生物质粒中的基因种类不同。河南科技大学16二、质粒载体的种类

（一）克隆载体

克隆载体主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。

克隆载体必须具备的基本条件：具有复制起点具有抗菌素抗性基因具有若干个限制酶单一识别位点具有较小的分子量和较高的拷贝数河南科技大学17噬菌体

噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的DNA，最常见的是双链线形DNA,且感染率高。0.02-0.3

m二、噬菌体(Bacterophage)载体河南科技大学18

噬菌体×275,000,Scanningelectronmicroscopy河南科技大学19基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种。为此，须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的此类基因。这样的基因通常称之为目的基因。目的基因主要是结构基因。目的基因：

纯度很高片断大小适于重组操作

第四节获得真核生物目的基因的方法河南科技大学20目的基因的获得方法分离化学合成

河南科技大学21一、利用PCR法获取目的基因PCR:polymerasechainreaction,聚合酶链式反应，是80年代发展起来的新技术，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。

摘要：

其过程与DNA复制一样有三个步骤：模板变性，引物与模板复性，延伸。河南科技大学222、PCR扩增，主要的是引物设计，引物设计需要遵循一定的原则。3、用于PCR的DNA聚合酶种类很多，性质各异，可以满足不同的实验需要。4、PCR技术应用广泛，可以通过A/T克隆、UDG克隆等方法介导克隆，还可以通过同源重组、重叠延伸等方法介导定点诱变。反向PCR，反转录PCR在基因操作中也扮演了重要角色。PCR技术还广泛应用于鉴定、诊断等领域。河南科技大学23（一）

PCR的基本原理

1．基本要素和扩增原理

基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。待拷贝的DNA称为模板，它可以是双链DNA也可是单链DNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。引物是DNA复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。DNA聚合酶是DNA复制的动力，在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。河南科技大学242．PCR扩增的步骤

首先将模板DNA置于92℃-96℃，进行变性（denaturation）处理，使dsDNA在高温下解链成为ssDNA，且热变性不改变其化学性质；然后退火（annealing），将温度降至37℃-72℃，使引物与模板的互补区相结合；最后，在72℃条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3'-OH端，合成DNA，这个步骤称为延伸（extension）。这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段。河南科技大学25河南科技大学26PCR河南科技大学27PCR：变性－退火－延伸河南科技大学28（三）PCR反应程序1．常规程序预变性

:94-96℃几十秒至几分钟变性：94℃、30秒钟退火：50-65℃、30秒钟；25～35次循环延伸：72℃、1分钟72℃保持3-7min4℃保存河南科技大学292．复性（退火）和延伸温度

复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。河南科技大学303．反应时间

变性步骤一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。河南科技大学314．循环次数

循环次数主要与模板的起始数量有关，在模板拷贝数为104～105数量级时，循环数通常为25～35次。平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。

河南科技大学32（五）循环条件的设定1、变性2、退火3、延伸4、循环次数河南科技大学33（六）引物设计原则通用原则：1、引物长度：15－30Nt为宜2、引物碱基尽可能随机分布3、引物内部不应自身形成二级结构4、两个引物之间不能形成互补结构5、引物3’末端与模板配对河南科技大学34RT-PCR河南科技大学35第七节

转基因技术（Transgenictechnology）河南科技大学36

转基因与转基因动物速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与