第三章 常用生物化学检验技术

第三章常用生物化学检验技术第一节光谱分析技术分光光度技术的基本原理分光光度计的基本结构分光光度计的操作方法分光光度技术的定性和定量方法按波长区域分1、紫外光谱：波长范围：200—400nm2、可见光谱：波长范围：400—760nm3、红外光谱：波长范围：760—1000nm200—------400—---------760—---1000nm紫外谱光可见光谱红外光谱光谱分析技术：利用物质的吸收光谱、发射光谱、散射光谱特征对物质进行定性、定量分析的技术。吸收光谱（absorptionspectrum）即物质对不同波长光的吸收程度不同而产生的光谱。发射光谱是由物质分子或原子吸收了外来的能量后发生分子或原子间的能级跃迁而产生的光谱。分类吸收光谱分析法：1、可见分光光度法、测定有色物质2、紫外分光光度法、测定无色物质3、红外分光光度法、测定物质结构发射光谱分析法1、火焰光度法、测定离子2、荧光法散射光谱分析法比浊法彩虹，又称天虹，简称虹，是气象中的一种光学现象，当太阳光照射到半空中的水滴，光线被折射及反射，在天空上形成拱形的七彩的光谱，彩虹的七彩颜色究竟是哪七种有不同的说法，东亚、中国对於七色光来说最普遍的说法是（从外至内）：红、橙、黄、绿、青、蓝、紫或红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫，而西方常用的排色则为后者去掉靛色而成为六色。一、分光光度技术的基本原理（一）、光的吸收现象和吸收曲线互补色光：两种颜色的光，按适当的强度、比例混合后可成为白色的光，这两种色光成为互补色光。朗伯-比尔定律：

I0：入射光强度C:溶液浓度

b:液层厚度I:透射光强度

T:透光度A:吸光度

k:吸光系数bI0I（二）、光吸收定律三、分光光度计的基本结构最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计

光源单色器比色杯检测器显示器五大部份结构：（一）光源光源定义：指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。光源种类：可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。

紫外光光度计常用氢灯作为光源。（二）单色器定义：将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分光系统或单色器。种类：滤光片棱镜光栅（三）比色杯又称为吸收池或比色皿材料：常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成

（五）显示器（四）检测器检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的装置。721可见分光光度计

722系列可见分光光度计

SP-756P紫外可见分光光度计TENSOR系列红外光谱仪

四、分光光度技术的定量测定方法测定原理1.物质对光线有选择性吸收作用。2.每种物质都具有其特征性的吸收光谱。3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质的浓度成正比。

（一）对比法（标准对照法）

实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。A标准=ε标准C标准L标准

A样品=ε样品C样品L样品

A：吸光度；ε：摩尔吸光度；C：溶液浓度；L：液层厚度因标准液和样品液中溶质为同一物质，

ε样品=ε标准因盛标准液和测定液的比色杯径长相同L样品=L标准故上二式可写成：A标准/A样品=ε标准C标准/ε样品C样品

C样品=A样品/A标准×C标准（2）标准曲线法

配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线，根据测得吸光度值从标准曲线上读得测定物的浓度。

标准曲线使用注意事项①标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。②吸光度在0.05-1.0范围内。③所作标准曲线仅供短期使用。④标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，避免误差产生。应用中注意的问题①Lambert-beer’slaw的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，稀溶液能很好的服从该定律，A宜在0.05～1.0之间，超过该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符②选择波长：最大吸收波长，因为a.灵敏；b.避免杂质干扰③参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶质以外所有的成分。

空白管：

测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。火焰光度法的定义火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测元素所发射的辐射强度来进行定量分析的方法。它是一种简化的发射光谱分析法。

火焰光度分析法火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测元素所发射的辐射强度来进行定量分析的方法。它是一种简化的发射光谱分析法。特点①快速：试样溶液于数分钟内可完成测定。②准确：火焰光源稳定性高，干扰少，误差为2％~5％，可用于微量分析和常量分析。③灵敏：分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达0．1～10×10－6g。④设备简单：被测试样易被火焰激发，产生的谱线较简单，且均在可见光区，故使谱线分离和测量的设备简单。⑤应用范围窄：主要用于碱金属和部分碱土金属的测定。仪器装置（1）FP640火焰光度计

火焰光度法分析示意图1.光源系统2.光学系统3.检测系统（一）、基本原理火焰光度法的定量原理与发射光谱相同。即：试样