近交系动物遗传质量的检测

近交系动物遗传质量的检测

从遗传角度来看，实验动物按基因纯合度可分为近交系、突变系、封闭群和混合系。其中近交系动物是遗传基因高度纯合的动物,具有遗传均质性和世界分布广泛的特点,被大量应用于生物医学研究领域。近交系动物又称之为纯系动物,是采用兄妹交配或亲子交配(父母与子女交配),连续繁殖20代以上而培育出来的纯品系动物。目前,主要是在小鼠和大鼠中育成近交系的品系,应用最广泛的是近交系小鼠。它们是胚胎学、生理学、遗传学研究的理想材料,也用于药效试验、安全评价等的动物实验。进行组织或肿瘤移植实验及制作某些有遗传因素的人类疾病的动物模型时,近交系动物必不可少。近交系动物的显著特征是基因纯合性及遗传稳定性。但影响遗传变异的因素很多,在培育、保种及繁殖生产中,存在着发生遗传变异或遗传污染的可能。例如DBA小鼠是世界上培育成功的第一个近交系小鼠,至今已有近百年的历史。但由于遗传变异,现在已经划分为DBA/1和DBA/2两个遗传特征不同的亚系。近交系动物的遗传质量监测,主要是检查近交系动物的同基因性及基因纯合性,其目的是为了及时发现由遗传污染或基因突变而引起的遗传改变。有关实验动物的国家标准规定了利用生化基因标记检测法、皮肤移植法和免疫标记基因检测法等进行常规监测。近年分子生物学技术发展迅速,可以直接检验动物基因组核酸的改变,为近交系动物的遗传监测提供了直接客观的途径。1有关测指标的测定C.C.Little于1909年在杰克逊实验室首次进行了毛色遗传实验,此后毛色观察一直是近交系质量检测的一个重要指标。如果在饲养群体中出现未预料到的毛色改变,可以用SNP(singlenucleotidepolymorphism,单核苷酸多态性)检测该动物,以此鉴别是由突变导致的还是由遗传污染导致的。如果SNP标记显示该异常小鼠有正确的遗传背景概貌,该小鼠将被交配来测定新毛色是否是遗传传递的。2异常表型的检测近交系特征可以是自发突变或饲养误差的一个指示器。在一个非肥胖的近交群中的一只肥胖的小鼠,可以是自发突变的结果,随着品系背景的确证(排除遗传污染),这只老鼠被饲养去鉴定变化的表型是否是遗传而来的。杰克逊实验室有两个计划从群体中去测定和排除潜在的新突变:一是异常表型的研究计划,用于鉴定偏离预期品系特征的小鼠;二是小鼠突变资源,产生于该群体的新自发突变在遗传上和表型上的特征。3一般标记3.1ssnp标记的扩增和测序单核苷酸多态性(SNPs)是指在基因组水平上由于单个核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变异所引起的DNA序列多态性。程振华等对四种近交系小鼠进行了DNA指纹分析,他们提取了4种近交系小鼠(A/J,BALB/c,C57BL/6J和DBA/2)的肝脏DNA,分别用HinfI和HACIII酶切,用人的33.15和自制的小鼠V2探针,用[α-32P]dCTP随机引物标记,Southern杂交,结果表明他们克隆的DNA片断V2具有较好的多态性,可作为小鼠的小卫星探针,用于实验动物的遗传检测。Petkov等选择了28个SNP,标记,这些标记覆盖了所有小鼠常染色体和X染色体,能区分所有的近交系小鼠,其结果显示该方法是一个快速、可靠及高效的遗传监测方法,这些SNP标记被用于随机监测已建立的群体中的所有种畜。SNP标记的发展极大地提高了鉴别近交系背景的能力。3.2星多态性分析微卫星,又称简单序列重复(Simplesequencerepeats,SSR),是指以少数几个核苷酸(1～10个,多数为2～4个)为单位多次串联重复的DNA序列。与生化标记相比,微卫星图谱对于建立遗传完整性更敏感。微卫星多态性产生独特的指纹图谱,它可以鉴别一个近交系小鼠的遗传概貌,目前人们选择了96个高多态性的微卫星标记,他们代表相当大的差异,能很容易地通过琼脂糖电泳区分。TaylorBA等运用PCR扩增近交系CAST/Ei小鼠的SSR,通过39个SSR变位就可检测CAST/Ei小鼠和普通小鼠常染色体的94%,实验结果显示微卫星标记是一个快速检测突变的方法。李瑞生等选取大鼠7条染色体上的微卫星位点合成了10对引物,利用PCR技术对6个品系(SHR、SHRSP、LEW、RCS、WKY和F344)的8个近交系大鼠群体进行了DNA多态性分析的研究。结果表明:9个微卫星位点具有显著多态性:不同晶系个体之间具有多态性;不同地区同一品系的不同个体之间也存在一定的差异.该方法为近交系大鼠的遗传背景监测提供了可靠的信息。3.3rapd—随机扩增多态性DNA(RAPD)1990年,Williams和Welsh等同时提出了RAPD(randomamplifiedploymorphicDNA;随机扩增多态性DNA)标记。它不需预先知道目标序列,可随机扩增DNA片段,检测个体之间的多态性,是检测DNA概貌的一个强有力的技术。SuzanneA等应用RAPD-PCR技术检测了近交系实验小鼠的遗传变异,研究结果显示RAPD-PCR适于分析同一群体不同个体之间和同一物种不同群体之间的遗传相关性和变异性。Ponsuksili等应用RAPD—PCR检测了出身和饲养导致的遗传变异。Parker等研究显示,等位基因变异与RAPD—PCR扩增的一个特定DNA片段的存在或缺乏有关。在群体的遗传特性、环境研究、品种鉴定、饲养分析、遗传相关性和生物多样性研究等方面,RAPD—PCR技术均显示其为一项灵敏的技术。3.4山医群体的肽谱检测黄才国等建立了山医群体近交系中国地鼠的肽斑图谱,通过单体和混合群体的肽谱比较显示,应用基因肽谱技术可检测山医群体近交系中国地鼠群体遗传纯度。3.5fish技术的优势自20世纪80年代末,Pinkel和Heiles将FISH技术引入染色体检测领域后,FISH技术就在各项科研工作中得到了广泛的运用,显示出与一些传统技术相比的明显优势。FISH技术不仅有极低的假阳性、假阴性的比例,还能对同一样本进行多次的FISH操作以及利用不同颜色的荧光探针一次检测多个染色体或基因的异常。通过FISH可以对染色体或特定基因的数目异常,特定片断的缺失、易位和重排进行检测。4生物化学评价、基因识别和免疫标记等技术4.1小鼠染色体细胞系统的基因型检测各种近交系小鼠、大鼠在生化多态性位点上都具有各自特定的等位基因,可作为遗传质量监测的依据。近交系小鼠选择位于10个染色体上的13个生化位点,近交系大鼠选择7个生化位点,作为遗传检测的生化标记。人们常规检查代表7条染色体的10个同工酶,通过5个或更少的同工酶加上毛色测试,大多数近交系能被鉴别。ICLAS监测中心从19个标准遗传标记中选择15个,检查品系的遗传背景。4.2皮肤移植试验MHC是组织相容性最强的决定因素,它决定组织接受或拒绝。H2是小鼠的MHC,它定位在17号染色体(8、9)。1959年Bellingham和Silvers提出皮肤移植法,用以检查近交系的纯度,亦可检查品系有无污染。通过观察同系异体皮肤移植物能否接受可以判定组织相容性基因的异同。杨维东等采用免疫组化方法,通过检测骨组织移植后宿主淋巴细胞白细胞介素—2受体的表达,来判定近交系小鼠H2基因的纯合性。结果与皮肤移植结果一致。提示该方法可作为近交系小鼠的遗传检测手段之一。4.3ea9的存在或缺乏Ea通过红血球凝聚试验来测定,可和其他标记一Ea起用于区分同一基因型的品系。,人们常常测定Ea9的存在或缺乏。例如,C57BL/6J和C57BL/10同为23个同工酶,毛色是黑色,都是H2b.然而在Ea9处它们是不同的,C57BL/6J是Ea9a(有抗原),C57BL/10是Ea9b(缺乏抗原)。4.4hc和其它方法血清中溶血补体的存在或缺乏,对于区分一些品系也许是有用的。DBA/1J、BALB/cJ、C57BL/6是Hc阳性,而DBA/2J和其它的是Hc阴性。因为用其他方法可以更容易地测评