第十章RNA的生物合成

第十章RNA的生物合成(TheBiosynthesisofRNA)执行生命功效、体现生命特性的重要物质是蛋白质分子。DNA贮存着决定生物特性的遗传信息，只有通过蛋白质才干体现出它的生命意义，直接决定蛋白质合成及蛋白质特性的不是RNA而是DNA，因而人们拟定DNA是遗传信息贮存者后就推测DNA是通过RNA去决定蛋白质合成的。50年代末RNA聚合酶的发现开始证明了这一推测。以DNA为模板合成RNA的过程称为转录（transcription）。RNA的生理功效：DNA将携带的遗传信息转到RNA分子中，RNA分子以其信息指导蛋白质的合成。mRNAtRNArRNA转录是生物界RNA合成的重要方式，是遗传信息朋DNA向RNA传递过程，也是基因体现的开始。mRNAtRNArRNA转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolynerase,DDRP）。转录产生初级转录物为RNA前体（RNAprecursor），它们必须通过加工过程变为成熟的RNA，才干体现其生物活性。第一节转录作用RNA的转录合成从化学角度来讲类似于DNA的复制，多核苷酸链的合成都是以5'→3'的方向，在3'-OH末端与加入的核苷酸磷酸二酯键，但是，由于复制和转录的目的不同，转录又含有其特点：（1）对于一种基因组来说，转录只发生在一部分基因，并且每个基因的转录都受到相对独立的控制；（内含子，不出现转录生成的mRNA中的一种序列，DNA（外显子1+内含子1+外显子2+内含子2）→单链RNA（外显子1+内含子1+外显子2+内含子2）→成熟单链RNA（外显子1+内含子1+外显子2+内含子2）。（2）转录是不对称的；（3）转录时不需要引物，并且RNA链的合成是持续的。基因：是遗传物质的最小功效单位。是特定的DNA片段，这些片段中有些是为一种或几个蛋白质（酶）的全部AA编码的核苷酸次序，称为基因或基因组。一、RNA聚合酶真核和原核细胞内都存在有DDRP，迄今发现的DDRP的有下列特点：1）以DNA为模板-链+链-链+链在体内DNA的两条链中仅有一条链可用于转录；或者在某些区域以这条链转录，另某些区域以另一条链转录。2）都以四种三磷酸核苷为底物、原料；3）都遵照DNA与RNA之间的碱基配对，A=U，T=A，C=G，合成与模板DNA序列互补的RNA链。4）RNA链的延长方向是5'→3'的持续合成。5）需要Mg2+或Mn2+离子。6）并不需要引物。RNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，故没有校正功效。大肠杆菌RNA聚合酶（由5个亚基构成）的研究得比较透彻的，这是一种分子量达50多万，全酶由5个亚基构成，去掉δ亚基的部分称为核心酶，核心酶本身就能催化核苷酸间磷酸二酸键形成。α2ββ'σ为全酶，α2ββ'为核心酶。全酶还含有2个Zn2+。利福平和利福霉素能结合在β亚基上而对此酶发生强烈的克制作用。β亚基似乎是酶和核苷酸底物结合的部位。细胞内转录是在DNA特定的起始点上开始的；α亚基可能与转录基因的类型和种类有关；β'亚基是酶与DNA模板结合的重要成分；σ亚基的功效是识别转录起始点的；与启动子结合，参加基因转录的起始，一旦引发RNA的合成，就与核心酶a2ββ'分离。α、β、β'亚基在不同细菌中的大小比较恒定，而σ亚基的变化较大。原核生物只有一种酶，转录三种RNA（mRNA、rRNA、tRNA）前体。真核生物中已发现有四种RNA聚合酶，分别称为RNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和线粒体RNA聚合酶，分子量大致都在50万道尔顿左右，它们专一性地转录不同的基因，因此由它们催化的转录产物也各不相似。RNA聚Ⅰ合成RNA的活性最明显，它位于核仁中，负责转录编码rRNA的基因。而细胞内绝大部分RNA是rRNA。RNA聚合酶Ⅱ位于核质中，负责核内不匀一RNA的合成，而hnRNA是mRNA的前体。RNA聚合酶Ⅲ负责合成tRNA和许多小的核内RNAs。鹅膏蕈碱是真核生物RNA聚合酶特异性克制剂，三种真核生物RNA聚合酶对鹅膏蕈碱的反映不同。原核生物靠RNA聚合酶就可完毕从起始、延长、终止的转录全过程，真核生物转录除RNA聚合酶外还需另一此叫做转录因子的蛋白质分子参加转录的全过程。类型分布转录产物对α-鹅膏蕈碱的敏感性分子量(kD)反映条件Ⅰ核仁rRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA不敏感500~700低离子强度,规定Mg2+或Mn2+Ⅱ核质hnRNA（mRNA前体）克制（高度敏感）~700高离子强度Ⅲ核质tRNA和5SrRNA前体克制（中度敏感）-高Mn2+浓度RNA聚合酶缺少核酸外切酶活性，不含有校对功效，因此RNA转录的保真度比DNA复制低的多。二、RNA的转录过程 为研究和叙述方便，可将RNA合成分为识别与起始、延长和终止三个阶段。（一）识别转录是从DNA分子的特定部位开始的，这个部位也是RNA聚合酶全酶结合的部位这就是启动子，是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。普通位于转录起点的上游，约涉及40个碱基对。为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢？显然启动子处的核苷酸序列含有特殊性，为了方便，人们将在DNA上开始转录的第一种碱基定为+1，沿转录方向顺流而下的核苷酸序列均用正值表达；逆流而上的核苷酸序列均用负值表达。对原核生物的100多个启动子的序列进行比较发现：在RNA转录起始点上游大概-10bp和-35bp处有两个保守的序列：在-10bp附近，有一组5'-TATAAT的序列，这是Pribnow首先发现的称为Pribnow框或称为-10序列，富含AT，有助于DNA双螺旋的局部解链，全酶结合部位。-35bp附近，有一组5'-TTGACG-的序列叫识别区或-35序列；已被证明与转录起始的识别有关，是RNA聚合酶中的δ亚基识别并结合的位置。-35序列的重要性还在于在很大程度上决定了启动子的强度。RNA聚合酶全酶识别部位，约含12bp。Pribnow框Pribnow框真核生物的启动子有其特殊性，真核生物有三种RNA聚合酶，每一种都有自己的启动子类型。以RNA聚合酶Ⅱ的启动子构造为例，人们比较了上百个真核生物RNA聚合酶Ⅱ的启动子核苷酸序列后发现：在-25区有TATA框，又称为Hogness框或Goldberg-Hogness框。其一致序列为T82A97A93A85A63T37A83A50T37，基本上都由A，T碱基所构成，离体转录实验表明，TATA框决定了转录起点的选择，天然缺少TATA框的基本能够从一种以上的位点开始转录。在-75区有CAAT框，其一致的序列为GGTCAATCT。有实验表明CAAT框与转录起始频率有关。除启动子外，真核生物转录起始点上游处尚有一种称为增强子的序列，它能极大地增强启动子的活性，它的位置往往不固定，可存在于启动子上游或下游，对启动子来说它们正向排列和反向排列都有效，对异源的基因也起到增强作用，但许多实验证明它仍可能含有组织特异性，例如免疫球蛋白基因的增强子只有在B淋巴细胞内活性最高，胰岛素基因和胰凝乳蛋白酶基因的增强子也都有很高的组织的特异性。（二）转录起始和延伸在原核生物中，当RNA聚合酶的σ亚基发现其识别位点时，全酶就与启动子的-35区序列结合形成一种封闭的启动子复合物。全酶分子较大，其另一端可达成-10区的序列，在某种作用下，整个酶分子向-10序列转移并与之牢固结合，在此处形成全酶和启动子的开放性复合物。在开放性启动子复合物中，起始位点和延长位点被对应的核苷酸前体充满，在RNA聚合酶β亚基催化下形成RNA的第一种磷酸二酸键。RNA合成的第一种核苷酸总有GTP或ATP，以GTP常见，此时σ因子从全酶解离下来，靠核心酶在DNA链上向下游滑动，而脱落的σ因子与另一种核心酶结合成全酶重复运用。真核生物转录起始十分复杂，往往需要多个蛋白因子的协助，已经懂得，在全部的细胞中有一类叫做转录因子的蛋白质分子，它们与RNA聚合酶Ⅱ形成转录起始复合物，共同参加转录起始的过程。RNA聚合酶Ⅰ和RNA聚合酶Ⅲ的启动子种类有限，对其识别所需的辅助因子的数量也极少。RNA聚合酶Ⅱ的启动子序列多个多样，基本上由多个顺式作用元件组合而成，分散在转录起点上游大概200bp的范畴内。参加RNA聚合酶Ⅱ转录起始的各类因子数目很大，可分为三类：通用因子、上游因子和可诱导因子。类别Ⅰ启动子只控制rRNA前体基因的转录，转录产物经切割和加工后生成多个成熟的rRNA。该基因有许多拷贝，往往成簇存在。由两部分保守序列构成。核心启动子位于转录起点附近，从-45至+20；上游控制元件位于相对分子质量为97000的多肽链，可结合在富含GC区。类别Ⅱ启动子涉及众多编码蛋白质的基因体现的控制，涉及4类控制元件：基本启动子、起始子、上游元件和应答元件。这些元件的不同组合，再加上其它序列的变化，构成数量十分庞大的多个启动子，并受各自对应转录因子的识别和作用。也可大致分为构成型体现（在各类细胞中体现）和诱导型体现（受时序、空间和多个内外条件的调节）。基本启动子序列为以-25至-30左右的7bp保守区为中心。它的辅助因子称为通用转录因子，是由多个蛋白质分子构成的，其中涉及特异结合在TATA盒上的蛋白质，叫做TATA盒结合蛋白；尚有一组复合物叫做转录因子用TFⅡX来表达。如TFⅡA、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡF、TFⅡH等。与TATA盒结合的先后次序为：TFⅡD、TFⅡA、TFⅡF、TFⅡD、TFⅡE、TFⅡH。类别Ⅲ启动子为RNA聚合酶Ⅲ所识别，涉及某些小分子RNA的转录。RNA链的延长靠核心酶的催化，在起始复合物上第一种GTP的核糖3'-OH上与DNA模板能配对的第二个三磷酸核苷起反映形成磷酸二酯键。聚合进去的核苷酸又使核糖3'-OH游离，这样就可按模板DNA的指导，一种接一种地延长下去。因此RNA链的合成方面也是5'→3'。由于DNA链与合成的RNA链含有反平行关系，因此RNA聚合酶是沿着DNA链3'→5'方向移动。整个转录过程是由同一种RNA聚合酶来完毕的一种持续下断的反映，转录的RNA生成后，临时与DNA模板链形成DNA·RNA杂交体，长度约为12个碱基对，形成一种转录泡。转录速度大允是每秒钟30-50个核苷酸，但并不是以恒定速度进行的。在电子显微镜下观察转录现象，能够看到同一DNA模板上，有长短不一的新合成的RNA链散开成羽毛状图形，这阐明在同一DNA基因上能够有诸多个的RNA聚合酶在同时催化转录，生成对应的RNA链。并且较长的RNA链上已看到核糖体附着，形成多聚核糖体。阐明某些状况下，转录过程未完全终止，即已开始进行翻译。转录的延长阶段，原核生物与真核生物之间没有太大差别。（三）转录的终止（Termination）转录是在DNA模板某一位置上停止的，人们比较了若干原核生物RNA转录终止位点附近的DNA序列，发现DNA模板上的转录终止信号有两种状况，一类是不依赖于蛋白质因子而实现的终止作用，另一类是依赖蛋白质辅因子才干实现终止作用，这种蛋白质辅因子称为释放因子，普通又称ρ因子。两类终止信号有共同的序列特性，在转录终止之前有一段回文构造，回文序列是一段方向相反，碱基互补的序列，在这段互补序列之间由几个碱基隔开，不依赖ρ因子的终止序列中富含G·C碱基对，其下游6-8个A；而依赖ρ因子的终止序列中G·C碱基对含量较少，其下游也没有固定的特性，其转录生成的RNA可形成二级构造即柄-噜噗构造，又称发夹构造，这样的二级构造可能与RNA聚合酶某种特定的空间构造相嵌合，妨碍了RNA聚合酶进一步发挥作用。除DNA模板本身的终止信号外，在λ噬菌体中，发现某些蛋白质有协助RNA聚合酶跨越终止部位的作用，叫做抗转录终止蛋白，例如入噬菌体的N基因产物。真核生物由于RNA转录后很快就进行了加工，因此很难拟定原初转录物的3'末端。病毒SV40的终止位点通过研究发现，很像大肠杆菌的不依赖ρ因子的终止子，转录后的RNA可形成一种发夹构造，3'末端带有一连串的U。爪蟾5sRNA的3'末端有4个U，它们前后的序列为富含G·C的序列，这是全部真核生物RNA聚合酶Ⅲ转录的终止信号。这种序列特性高度保守，从酵母到人都很相似，任何变化这种序列特性的突变都将造成转录终止位置的变化。图:DNA指导下的RNA转录过程示意图图:RNA聚合酶沿DNA模板链移动合成RNA第二节RNA转录后的加工与修饰不管原核或真核生物的rRNA都是以更为复杂的初级转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA分子。然而绝大多数原核生物转录和翻译是同时进行的，随着mRNA开始在DNA上合成，核蛋白体即附着在mRNA上并以其为模板进行蛋白质的合成，因此原核细胞的mRNA并无特殊的转录后加工过程。相反，真核生物转录和翻译在时间和空间上是分开的，刚转录出来的mRNA是分子很大的前体，即核内不均一RNA。hnRNA分子中大概只有10%的部分转变成成熟的mRNA，其它部分将在转录后的加工过程中被降解掉。一、mRNA的加工修饰原核生物中转录生成的mRNA为多顺反子，即几个构造基因，运用共同的启动子和共同终止信号经转录生成一条mRNA，因此此mRNA分子编码几个不同的蛋白质。例如乳糖操纵子上的Z、Y及A基因，转录生成的mRNA可翻译生成三种酶，即半乳糖苷酶，透过酶和乙酰基转移酶。原核生物中没有核膜，因此转录与翻译是持续进行的，往往转录尚未完毕，翻译已经开始了，因此原核生物中转录生成的mRNA没有特殊的转录后加工修饰过程。真核生物转录生成的mRNA为单顺反子，即一种mRNA分子只为一种蛋白质分子编码。真核生物mRNA的加工修饰，重要涉及对5'端和3'端的修饰以及对中间部分进行剪接。1.外显子的剪接〔mRNA前体（hnRNA）的拼接〕 原核生物的构造基因是持续编码序列，而真核生物基因往往是断裂基因，即编码一种蛋白质分子的核苷酸序列被多个插入片断所隔开，一种真核生物构造基因中内含子的数量，往往与这个基因的大小有关，例如胰岛素是一种很小的蛋白质，它构造基因只有两个内含子，而有些很大的蛋白质，它的构造基因中能够有几十个内含子。通过复杂的过程后，切去内元，将有编码意义的核苷酸片段（Extron外元也叫外显子）连接起来。真核生物的构造的基因中含有可体现活性的外显子，也含有无体现活性的内含子。但内含子序列不是无意义的，越来越多的实验证明有许多基因中的内含子参加基因体现调控，在转录时，外显子及内含子均转录到hnRNA中。在细胞核中hnRNA进行剪接作用，首先在核酸内切酶作用下剪切掉内含子；然后在连接酶作用下，将外显子各部分连接起来，而变为成熟的mRNA，这就是剪接作用，也有少数基因的hnRNA不需进行剪接作用，例如α-干扰素基因。mRNA前体剪接机制：mRNA拼接反映需要有核内小分子RNA(snRNA)参加，它们与蛋白质形成的复合物称为小核糖核蛋白颗粒（SnRNP），构成剪接体。剪接体催化外显子的剪接，剪接体通过本身snRNA和转录物之间碱基互补来识别剪接位点。剪接时，在磷酸二酯键上的羟基进行2步持续亲核攻击，内含子先形成一种附在链上的套环（带有尾巴）。随即释放游离的套环，套环在核内降解。不管拼接过程如何，拼接必须极为精确，否则会造成遗传信息传递障碍，合成的蛋白质可能丧失其正常的功效。我国南方广大地区的β-地中海贫血是由于β-珠蛋白链的合成受到部分或完全克制所引发的，是一种血红蛋白病。加工成熟的mRNA虽能翻译，但产物不是正常的β-珠蛋白，成果引发血红蛋白级构造和功效的变化。2.5'-端加帽子构造成熟的真核生物mRNA，其构造的5'端都有一种m7G5'Nppp5'Np构造，称为甲基鸟苷的帽子。加帽反映可分为4步：Mg2+5'mRNA3'5'mRNA3'⑴Mg2+5'mRNA3'5'mRNA3'PPP+H2OPP+Pi⑵从GTP上将GMP转移到加帽酶的赖氨酸的ε-NH2上E-lys+GTP→E-lys-GMP+ppi⑶将GMP从酶转移至mRNA的5'端的焦磷酸基上5'mRNA3'5'mRNA3'E-lys-GMP+PPGPPP+E-lys5'mRNA3'5'mRNA3'⑷由S-腺苷甲硫氨酸在5'端鸟嘌呤的N7处甲基化(m7G)，和5'端1或2个核苷酸的核糖上的C2处甲基化。戴帽重要为保护mRNA5'端不被核酸酶降解，有助于mRNA在核糖体上定位。5'端帽子的功效可能在翻译过程中起识别作用以及对mRNA起稳定作用，保护mRNA免遭5'外切核酸酶的攻击。3.在3'端加尾大多数的真核mRNA都有3'端的多聚尾巴（A），多聚（A）尾巴大概为200bp。 多聚（A）尾巴不是由DNA编码的，而是转录后在核内加上去的。受polyA聚合酶催化，该酶能识别，mRNA的游离3'-OH端，并加上约200个A残基。（以下图）在大多数真核基因的3'端有一种AATAA序列，这个序列是mRNA3'端加polyA尾巴的信号。靠核酸酶在此信号下游10-15碱基外切断磷酸二酯键，在polyA聚合酶催化下，在3'-OH上逐个引入100-200个A碱基。有关polyA尾巴的功效问题尽管通过极其广泛的探索，但还不完全清晰。有人推测polyA可能与mRNA从细胞核转送到细胞质有关，但是相称数量的没有polyA尾巴的mRNA，如组蛋白mRNA，也照样通过核膜进入细胞质。尚有人认为这种构造对真核mRNA的翻译效率含有某种作用，并能稳定mRNA构造，保持一定的生物半衰期。4.mRNA的内部甲基化真核生物mRNA分子内部往往有甲基化的碱基，重要是N6-甲基腺嘌呤（m6A）。这类修饰成分有的在hnRNA中已经存在。其功效可能对mRNA前体的加工起识别作用。二、rRNA转录后加工 原核生物rRNA转录后加工，涉及下列几方面：①rRNA前体被大肠杆菌RNaseⅢ,RNaseE等剪切成一定链长的rRNA分子；②rRNA在修饰酶催化下进行碱基修饰；③rRNA与蛋白质结合形成核糖体的大、小亚基。真核生物rRNA前体比原核生物大，哺乳动物的初级转录产物为45S，低等真核生物的rRNA前体为38S，真核生物5SRNA前体独立于其它三种rRNA的基因转录。真核生物rRNA前体中含有插入次序，rRNA前体要形成成熟的rRNA，需要通过拼接反映。例如，四膜虫的rRNA前体的拼接是一种无酶催化的自动拼接过程。在四膜虫基因组内，26SrRNA编码的区域内有413bp的插入次序。该插入序列能够不消耗能量从rRNA前体中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破坏酶活性方法，都不能破坏拼接活性，但反映中Mg2+和鸟嘌呤核苷酸是必需的。用32P-GTP进行追踪实验表明，起始过程是GTP在插入次序5'端发生亲核反映，同时GMP与5'端切点的切除段形成磷酸二酯键并使原RNA断开。第二步是5'切点的外元3'-OH与3'切点的外元5'-P共价连接，获得成熟的rRNA，被切除部分最后环化，形成一种环状构造，同时从5'端去掉一种15核苷酸片断。剩余部分连接成399核苷酸的环状产物，再通过几步，最后切下一种19个核苷酸的线性内含子序列即L-19，它含有催化活性，上面的剪接作用，是由内含子本身的催化性质决定的（见下图）。这种rRNA的本身剪接反映给人们一种提示：即RNA分子也有酶的催化活性。这向酶化学-本质是蛋白质这一传统概念提出了挑战。这种有酶催化活性的RNA分子命名为Ribozyme。T.Cech和S.Altman各自分别发现RNA含有催化作用，他们的发现对于理解生命进行过程有重要意义。三、tRNA转录后的加工修饰原核生物和真核生物刚转录生成的tRNA前体普通无生物活性，需要进行下列环节：①剪切和拼接；②碱基修饰；③3'-OH连接-ACC构造（以下图）。1.tRNA前体在tRNA剪切酶的作用下，切成一定小的tRNA分子。大肠杆菌RNaseP可特异剪切tRNA前体的5'端多出的核苷酸，因此，该酶被称为tRNA5'成熟酶。RnaseP是一种非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白质构成，近来发现RNAaseP分子中的RNA部分在某些条件下，能够单独地催化tRNA前体的加工成熟，这阐明RNA分子确实含有酶的催化活性。通过剪切后的tRNA分子还要在拼接酶作用下，将成熟tRNA分子所需的片段拼起来。除了RnaseP外，tRNA前体的剪切尚需要一种3'-核酸内切酶，可将tRNA前体3'端的一段核苷酸序列切下来。RNaseD是tRNA3'端的成熟酶，切除3'端多出的核苷酸。2.成熟的tRNA分子中有许多的稀有碱基tRNA分子经甲基化，脱氨基，还原反映等反映转变为稀有碱基。如tRNA在甲基转移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如A→mA，G→mA。有些尿嘧啶还原为双氢尿嘧啶。尿嘧啶核苷转变不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脱氨基为成为次黄嘌呤核苷酸（Ⅰ）。3.3'末端加上CCA：在核苷酸转移酶作用下，3'末端除去个别碱基后，换上tRNA分子统一的CCA-OH末端，完毕tRNA分子中的氨基酸臂构造。第三节RNA的复制一、RNA的复制以DNA为模板合成RNA是生物界RNA合成的重要方式。但有些生物像某些病毒、噬菌体以RNA为遗传物质，称为RNA病毒。它们的遗传信息贮存在RNA分子中，当它们进入宿细胞后，靠复制而传代，它们在RNA指导的RNA聚合酶催化下合成RNA分子，当以RNA模板时，在RNA复制酶作用下，按5'→3'方向合成互补的RNA分子,但RNA复制酶中缺少校正功效，因此RNA复制时错误率很高，这与反转录酶的特点相似。病毒RNA复制酶含有很高的模板专一性，只识别病毒本身的RNA，也就是说RNA复制酶只对病毒本身的RNA起作用,而不会作用于宿主细胞中的RNA分子。1.正链RNA病毒（脊髓灰质炎病毒）复制(+)RNA复制(+)RNA→细胞→复制酶和有关蛋白→(+)RNA/(-)RNA→(-)RNA/(+)RNA→(+)RNA病毒2.负链RNA病毒（狂犬病病毒）(+)RNA→复制酸+Pr(-)RNA+复制酶→细胞→(-)RNA/(+)RNA→→病毒(+)RNA/(-)RNA3.含有双链RNA的病毒（呼肠孤病毒）二、RNA生物功效的多样性1、RNA在遗传信息的翻译中起着决定作用。2、RNA含有重要的催化功效和其它持家功效。3、RNA转录后加工和修饰依赖于各类小RNA和其它蛋白质复合物。4、RNA对基因体现和细胞功效含有重要调节作用。5、RNA在生物进化中起重要作用。三、核酸合成的克制剂1.核苷酸合成克制剂氨基酸类似物、叶酸类似物、