高糖pds对腹膜间皮细胞线粒体结构与功能的影响

高糖pds对腹膜间皮细胞线粒体结构与功能的影响

膜透析（pd）是治疗末梢性肾疾病（esr）的有效方法之一，也是治疗后肾疾病（ulf）的主要原因之一。目前认为,高葡萄糖腹膜透析液(peritonealdialysissolution,PDS)引起细胞内线粒体所产生的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)增加,在PD患者腹膜间皮细胞(humanperitonealmesothelialcells,HPMC)氧化损伤、进而引起UFF过程中起关键作用,但具体机制并不清楚。我们的前期研究发现,在高糖PDS的环境下,高糖可以导致HPMC线粒体呼吸链功能紊乱,导致HPMC的氧化损伤。而既往研究表明,过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgammacoactivator1-alpha,PGC-1α)基因作为一个细胞核转录因子,可以调节高葡萄糖诱导的线粒体呼吸链活性、保持线粒体膜通透转运孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpores,mPTP)开闭状态的稳定,从而达到保护线粒体结构和功能稳定的目的,在抑制线粒体相关氧化损伤中起重要作用。但在高糖环境下的腹膜间皮组织,PGC-1α的表达是否与细胞线粒体功能以及线粒体相关凋亡途径有关,需要进一步的研究探讨。本研究通过深入研究HPMC细胞中高葡萄糖PDS对HPMC线粒体结构功能等的氧化损伤的作用,并探讨PGC-1α在高糖PDS环境下的变化,探讨高糖PDS引起UFF的可能分子机制,最终为靶向PGC-1α治疗,延缓UFF的发生发展,提供新的理论与实验依据。1材料和方法1.1细胞培养和分离以人腹膜间皮细胞株(HPMC)为细胞模型。人腹膜间皮细胞株(HMrSV5)由法国巴黎TENON医院肾疾病研究所Ronco教授构建,经上海市一医院肾内科姚建教授馈赠。细胞使用含10%胎牛血清的DMEM培养,2~3d更换培基,37℃,5%CO2条件下生长。细胞生长成片时用于实验。干预环境:不同浓度的PDS(1.5%,2.5%,4.25%);各PDS组使用相应浓度的葡萄糖腹透液与DMEM按1:1体积比混合后培养细胞。刺激时间为24h。1.2培养基和试剂Lipofectamine2000和TRIzol购自美国Invitrogen公司;DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司;兔抗PGC-1α抗体,β-actin多克隆抗体购自美国SantaCruz公司;抗兔二抗购自中国中杉金桥生物技术有限公司;细胞蛋白裂解液RIPA购自北京鼎国生物技术有限公司;TECL显影剂、PVDF膜购自美国Millipore公司。1.3胞构建和实验方法HPMC种入24孔板至生长融合后,同步24h,不同组干预液继续培养细胞24h后,取出细胞爬片,PBS洗2~3次,加入MitoSOX™Redreagent(MolecularProbes,Eugene,OR),稀释比例为1:1000,室温孵育15min,PBS洗2~3次后显微镜下拍照,每张取6个视野,每组实验重复3次。1.4酶混合物iv活性检测采用上海杰美基因医药科技有限公司提供的GENMED动物线粒体呼吸酶复合物(I~IV)活性检测试剂盒测量酶复合物I~IV的活性。即应用分光光度法测定心肌线粒体呼吸酶复合物I即NADH-辅酶Q还原酶、心肌线粒体呼吸酶复合物II即琥珀酸脱氢酶、心肌线粒体呼吸酶复合物III即辅酶Q-细胞色素C还原酶、心肌线粒体呼吸酶复合物IV即细胞色素氧化酶的活性变化。1.5氧化与氧化酶活性的测定运用GSH-Px、过氧化氢酶活性检测试剂盒检修线粒体相关的GSH-Px、过氧化氢酶的活性。1.6凝胶图像分析提取细胞总蛋白,按照蛋白质浓度取20µg总蛋白并加入loadingbuffer,100℃变性10min,变性样品点离后上样跑12%SDS。80V转膜60min。封闭2h。加入1:500PGC-1α多克隆抗体和1:1000β-actin单克隆抗体过夜,辣根过氧化酶标记的1:5000IgG二抗1h后ECL液显影。凝胶图像分析系统测量PGC-1α/β-actin的相对表达量。各组实验至少重复3次。1.7染色、培养Hoechst33258检测细胞凋亡,分组干预24h后,采用Hoechst33258染色,加入3.7%的多聚甲醛室温下固定20min;摇床上用PBS洗3次,每次5min;加入HHoechst33258100µL,室温孵育15min;摇床上用PBS洗3次,每次5min;荧光倒置显微镜下观察并拍照。1.8准差ue0afs的表示采用SPSS13.0统计软件包,实验结果采用均数±标准差(ue0af±s)表示,不同组之间的两两比较采用LSD检验,计量资料采用单因素方差分析(onewayANOVA)。P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1细胞线虫ros的生成细胞与各组干预液共同培养24h,MitoSOX™Red荧光探针检测细胞线粒体ROS的生成情况。与对照组比较,2.5%以及4.25%葡萄糖PDS组的细胞细胞质中线粒体ROS红色荧光明显增强,4.25%葡萄糖PDS组尤为明显,提示线粒体ROS的生成明显增加(图1)。2.2呼吸链混合物iii活性4.25%葡萄糖PDS对线粒体呼吸链复合物I,II和IV的活性影响不明显(P>0.05),而4.25%葡萄糖PDS与对照组比较可明显引起呼吸链复合物III活性下降(P<0.01,图2)。高糖PDS(4.25%)作用于HPMC12h后,明显抑制线粒体呼吸链复合物III活性(P<0.01),而干预时间达到24h后,呼吸链复合物III活性进一步下降,呈时间依赖性(图3)。2.3小鼠肝肾组织中抗氧化酶活性的变化抗氧化酶活性检测实验结果显示:高糖4.25%PDS作用于HPMC24h,肾小管上皮细胞线粒体提纯物中抗氧化酶catalase(图4)以及GSH-Px(图5)的活性明显下降,并呈明显的浓度依赖性(图4A,图5A)以及时间依赖性(图4B,图5B)。2.4小鼠骨髓嗜多染红细胞的染色Hoechst33258染色结果显示:4.25%高糖PDS干预HPMC24h后,可见正常对照组中细胞核被染成蓝色,其细胞核轮廓清楚,核染色均匀一致(图6A);1.5%PDS干预组(图6B)细胞核形态基本正常,与对照组类似。但在2.5%PDS干预组以及4.25%PDS干预组中可见,被染成蓝色的细胞核出现明显的凋亡形态学改变(图6C,6D),主要表现为:核染色强,并可见典型的核碎裂,核浓缩;4.25%PDS干预组凋亡细胞尤为明显(图6D)。2.5pge-1蛋白表达不同浓度的葡萄糖腹膜透析液(0,1.5%,2.5%,4.25%)作用于HPMC24h,Western印迹检测PGC-1α蛋白表达水平。结果发现:高糖PDS抑制PGC-1α蛋白表达呈浓度依赖性,浓度越高,其蛋白表达水平越低。4.25%PDS抑制PGC-1α蛋白表达水平作用显著(P<0.01,图7)3高糖pds诱导的hpmc细胞染色体氧化损伤中pgc-1的表达HPMC损伤是腹膜纤维化的始动因素,腹膜间皮层的受损是腹膜损伤的关键。研究证实,高糖腹透液及其反应产物可引起HPMCROS生成过多、蓄积,从而导致细胞的氧化损伤,可能是导致腹膜功能受损、通透性发生改变的原因之一。ROS是生物体内一类活性含氧化合物的总称,目前认为线粒体过度产生ROS是细胞凋亡的枢纽。线粒体、尤其是线粒体呼吸链复合物I和III,是ROS产生的主要来源之一,同样也是ROS攻击的主要目标。细胞的氧化应激损伤,可影响线粒体呼吸链复合物的活性,引起ROS增加,加重细胞的氧化损伤,形成恶性循环,进而引起细胞凋亡。这一系列的相应改变激活caspase家族。该家族中大部分成员都与细胞凋亡相关,并参与多种与凋亡有关的机体生理或病理性过程。这些成员受凋亡信号激发后以链式激活、级联放大的方式,最终特异性裂解死亡底物聚ADP核糖聚合酶片段化,导致细胞凋亡。笔者既往研究结果发现,高糖PDS诱导腹膜间皮细胞细胞跨细胞电阻值下降,通透性升高,同时线粒体相关活性氧生成明显增加,并伴有细胞凋亡激活。结合上述目前的研究观点,推测线粒体相关的氧化应激损伤以及细胞途径的激活,可能是导致腹膜间皮细胞损伤凋亡的重要途径之一。本次研究结果显示,高糖PDS能够诱导HPMC线粒体呼吸链复合物III的活性明显下降,线粒体相关的抗氧化物酶catalase以及GSH-Px的活性明显受到抑制,并且高糖PDS的浓度越高、干预时间越长,其活性受抑制更为明显。进而导致细胞线粒体ROS明显升高,同时伴有细胞凋亡途径的激活。线粒体ROS在细胞内进一步集聚,造成细胞受到氧化损伤,诱导细胞发生凋亡。提示高糖PDS诱导的HPMC的氧化损伤凋亡与线粒体的功能及相关抗氧化物酶的活性密切相关。而在这整个氧化凋亡过程中,线粒体相关的基因以及调节因子发生了什么变化,进而引起后续一系列线粒体氧化应激途径的激活呢?我们进一步研究了线粒体中一种重要的调节因子。PGC-1基因作为一个细胞核转录因子,共有PGC-1α,PGC-1β和PRC(PGC-1相关因子)3个成员。其中PGC-1α在线粒体的生成等功能中发挥重要作用。有研究显示,PGC-1α水平升高的细胞中,线粒体含量加倍。另外,PGC-1α可以通过线粒体的呼吸功能、调节脂肪酸的氧化、Krebs循环以及氧化磷酸化的酶的活力而刺激线粒体的生物合成。由此可见,PGC-1α在线粒体氧化损伤过程中,具有重要的作用和地位。因此我们推测,PGC-1α在高糖PDS诱导下HPMC线粒体氧化损伤中,可能起着重要的作用。本研究用不同浓度的PDS干预HPMC,检测PGC-1α的表达水平。结果显示,正常环境下HPMC表达PGC-1α蛋白,而随着PDS浓度的升高,蛋白表达水平逐渐下降,4.25%PDS干预下的PGC-1α蛋白表达下降明显。提示在高糖PDS环境下,PGC-1α蛋白是线粒体源性调控因子,与高糖PDS诱导细胞线粒体氧化损伤凋亡密切相关。而我们既往在糖尿