马铃薯p3300-ubi-wrky基因的克隆与分析

马铃薯p3300-ubi-wrky基因的克隆与分析

马蹄是中国最常见的种植和分发品种之一。这是中国的第四大谷物，在人们的日常生活和经济发展中发挥着重要作用。我国的耕地资源有限,淡水资源匮乏,越来越多的研究集中在如何改良马铃薯对逆境胁迫的抗性上。各种胁迫中,干旱对马铃薯的影响尤为突出,是影响马铃薯生长和产量的主要环境因子之一。由于植物的非生物胁迫抗性大多属于数量性状,现有的马铃薯种质基础中缺乏优异的基因资源,如采用常规育种技术,耗时费力,困难大。利用转基因技术可以将有价值的基因转入现有的优良品种中,又不改变品种本身所特有的优良性状,在较短的时间内获得新材料。本试验所用的WRKYⅡ转录因子是从厚叶旋蒴苣苔中克隆,并经过加工改造得到,与植物的生物胁迫应答以及干旱、低温、盐碱等非生物胁迫应答密切相关。将其导入马铃薯品种东农308和费乌瑞它中,期望获得抗旱的马铃薯材料,为马铃薯抗性育种提供新资源。1材料和方法1.1供试菌种和表达载体供试马铃薯品种为东农308和费乌瑞它(由东北农业大学提供)。供试农杆菌菌种为LBA4404,植物表达载体为利用Ubi启动子驱动的p3300-Ubi-WRKYⅡ(991bp)基因表达质粒(图1)(由北京大学生命科学学院林忠平教授提供)。1.2遗传转化体系的优化1.2.1不同的激素处理对莲藕再生的影响以MS培养基为基础添加生长调节剂玉米素(ZT)和吲哚乙酸(IAA),设计16种组合(见表1),筛选最佳激素浓度配比。1.2.2细菌溶液的浓度和污染时间对遗传转化的影响薯片侵染时综合考虑菌液浓度和侵染时间,设计16种组合(见表2),选择最优处理条件。1.2.3培训时间对遗传转化的影响将农杆菌侵染后的薯片共培养1d、2d、3d后转入分化培养基中培养20～30d,统计出芽率和污染率,确定最佳共培养时间。1.2.4抑菌效果的测定把共培养后的薯片分别接种于含0、150、300、450、600mg/L的进口头孢噻肟钠和哈药头孢噻肟钠固体培养基上,15d后统计抗生素的抑菌效果。1.2.5再生培养基浓度对叶片褐化率、出芽率的影响将薯片接种于PPT(phosphinothricin)浓度为1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mg/L的再生培养基中,30d后统计薯片褐化率、出芽率。1.3对后代的保存和生理检测1.3.1叶片的工程菌液制备取休眠期刚刚结束的东农308、费乌瑞它微型薯,表面消毒后,去皮切成大小为1cm2、厚度为1～2mm左右的薄片,用工程菌液(OD600=0.5)侵染7min,吸干薯片表面多余菌液后转入共培养培养基,进行暗培养。共培养结束后,转入分化培养基,诱导薯片出芽。待芽长到2～3cm时,切下转入生根培养基进行生根扩繁。1.3.2目标基因的扩增使用植物总DNA提取试剂盒(小量法)提取马铃薯植株总DNA,以转化植株的总DNA为模板,p3300-Ubi-WRKYⅡ质粒为阳性对照,未转化植株的总DNA作阴性对照,根据WRKYⅡ基因序列,设计特异性引物,对目标基因进行扩增。引物序列:WRKYⅡUp-5′CATGCCATGGGGCGGGAAATTGAG3′WRKRⅡDn-5′CGAGCTCAAGGAAAAGGAGCGTCAAAATC3′1.3.3琼脂糖凝胶电泳提取PCR检测结果呈阳性的植株总DNA,用HindⅢ酶切,酶切产物在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳,经变性、中和后,用高盐转移法将胶上的样品转到尼龙膜上,以目的基因WRKYⅡ为探针,采用地高辛标记试剂盒进行杂交,洗膜后显影。1.3.4植株生理指标的测定将转基因植株和对照植株培养15～20d,移入小盆中,3周后将其转入网室。转基因材料东农308、费乌瑞它及对照植株各种一行,行长10m,行距70cm,待苗长至15～16片叶时浇足水,取其顶部3～4片叶测定生理指标,3次重复,然后遮盖防雨棚对其进行干旱处理,持续15d不浇水,取样测定其生理指标:叶片保水力、相对含水量、叶绿素和脯氨酸含量。薯片再生培养及抗旱试验过程见彩插4图版1～8。2结果与分析2.1遗传转化体系的优化2.1.1养基叶片诱导出芽率由图2可以看出,东农308和费乌瑞它接种M11培养基薯片诱导出芽率最高,分别为92.8%和85.7%。因此最终确定的薯片再生培养基为M11(MS+ZT4.0mg/L+IAA1.0mg/L)。2.1.2东农243表土适宜率调查由表3可以看出,当菌液浓度OD600=0.5、侵染时间为7min时,东农308薯片出芽率为90.01%、污染率为2.41%,费乌瑞它薯片出芽率为82.65%、污染率3.14%。因此,薯片的最佳侵染浓度为OD600=0.5、侵染时间为7min。2.1.3t-dna片段向细胞内转移的培养外植体与农杆菌共培养是T-DNA转移到植物细胞的过程,共培养时间的长短关系到T-DNA片段向细胞内转移的过程是否能够完成,但是共培养时间过长污染率又会上升。如图3所示,东农308和费乌瑞它的最佳共培养时间均为2d,出芽率分别达到92.83%和85.45%,污染率仅分别是6.75%和7.87%。2.1.4进口头孢噻钠的脱菌用量由表4可见,哈药头孢噻肟钠和进口头孢噻肟钠浓度分别为450mg/L、150mg/L时,薯片的污染率为0,因此确定的脱菌抗生素是浓度为150mg/L的进口头孢噻肟钠。2.1.5模拟出芽率测定如表5所示,东农308在PPT浓度为4.0mg/L时,费乌瑞它在PPT浓度为3.5mg/L时,只有极少数薯块分化出芽,出芽率分别为2.41%和2.76%,而且随着时间的延长,部分芽逐渐白化,最后死亡。根据以上试验结果,本试验东农308采用PPT浓度4.0mg/L,费乌瑞它采用PPT浓度为3.5mg/L。2.2抗性植株pcr检测经过20～30d分化培养,东农308和费乌瑞它获得的抗性植株分别为30株和25株。对抗性植株进行PCR检测,分别有24株和21株呈阳性(图4、图5),特异条带长度991bp。对PCR检测呈阳性的植株做Southern-blot检测,东农308和费乌瑞它分别有7株和5株呈现阳性(图6)。2.3不同含量的叶绿素和脯氨酸含量由表6可看出,在正常浇水情况下,转基因植株和对照植株的叶片保水力、相对含水量、叶绿素含量、脯氨酸含量差异不显著;在水分胁迫15d后,转基因植株的叶片保水力、相对含水量、叶绿素含量和脯氨酸含量均显著高于对照植株,表明转WRKYⅡ基因的马铃薯抗旱能力高于对照。3对农杆菌外植体的感染时间和菌液浓度对传导率的影响不同再生培养基中激素的种类和浓度是影响再生的关键因素,在含有合适配比的生长素和细胞分裂素的培养基中外植体会诱导出愈伤组织。从以往马铃薯再生培养的经验来看,比较α-萘乙酸(NAA)、2,4-D、ZT、IAA、细胞分裂素(6-BA)和赤霉素(GA3)6种激素的使用效果,IAA和ZT配合使用效果较好。本试验设计16种IAA和ZT的不同配比组合,当ZT浓度为4.0mg/L、IAA浓度为1.0mg/L时,薯片再生情况最好。农杆菌的浓度和外植体的侵染时间对其遗传转化效率有显著的影响。菌液浓度过低,农杆菌无法侵染外植体,会大大降低转化率;菌液浓度过高,又容易使外植体产生过敏反应,导致伤口褐化,同时在分化阶段脱菌困难。转化中侵染时间过短农杆菌尚未接种到伤口面,转化率低;外植体在菌液中浸泡时间过长,常因农杆菌毒害缺氧而软腐,也会造成分化阶段脱菌困难。本试验中,当菌液浓度OD600=0.5、侵染7min时薯块出芽率高,而且褐化率和污染率保持在较低的水平。共培养结束后,外植体的表面以及表层细胞中共生有大量农杆菌,所以在培养基中必须加入脱菌抗生素。由于抗生素不仅对农杆菌有抑制作用,对植物细胞也有一定生物效应,会对外植体的生长及诱导抗性芽产生影响。本试验就哈药头孢噻肟钠和进口头孢噻肟钠进行了比较,结果表明较低浓度的进口头孢噻肟钠能够有效抑制农杆菌滋生,对植物细胞损害小,薯片生长状况良好,颜色鲜绿,再生芽丛生且茁壮。叶片保水力反映了叶片内部结构抵御水分散失的能力;叶片相对含水量能密切反映水分供应与蒸腾之间的平衡关系;叶绿素是植物