第六讲基因工程复习

基因工程复习课一、基因工程的概念基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作对象操作环境操作水平基本过程结果生物体外基因DNA分子水平剪切、拼接、导入、表达人类需要的基因产物基因工程：

通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。基因拼接技术或DNA重组技术（2010全国Ⅱ）下列叙述符合基因工程概念的是()A．B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上B1、“基因剪刀”——限制性核酸内切酶二、基因操作的工具限制酶限制酶切开的是什么键？（左上与右下相同，左下与右上相同）磷酸二脂键限制性核酸内切酶1、特点：2、结果：3、功能：4、来源：专一性（即识别特定核苷酸序列，在特定的切点切割）产生黏性末端（碱基互补配对）或平末端切开每条链中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二脂键微生物左上与右下相同左下与右上相同2、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？切断几个磷酸二酯键？可产生几个黏性末端？要切两个切口,断四根磷酸二酯键，产生四个黏性末端。3、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，可以合成重组的DNA分子了。思考：1、限制性核酸内切酶与DNA水解酶相比有何不同？DNA水解酶将DNA分子水解成单个核苷酸，限制性核酸内切酶只能将DNA分子分解成特定的DNA片段2、“基因的针线”——DNA连接酶

思考：DNA连接酶与DNA聚合酶的作用有何不同？作用实质：结果：具有缝合DNA片段的作用（用同一种限制酶切开的不同来源的DNA的黏性末端之间的缝隙“缝合”起来）形成磷酸二酯键DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键种类：质粒的特点：3、运载体－－能将外源基因送入细胞的工具（3）常含有标记基因（如：抗生素抗性基因、抗生素合成基因、固氮基因、色素基因）质粒、噬菌体可以将外源基因载入大肠杆菌等宿主细胞中，而植物病毒和动物病毒能够将外原基因分别带到植物细胞和动物细胞中质粒、噬菌体和动植物病毒。（1）细胞质中能自主复制的小型双链环状DNA分子；以独立于染色体（或拟核DNA分子）之外的方式存在。（2）存在于许多细菌及酵母菌等生物体内（4）能在受体细胞中复制并稳定保存（5）具有一个至多个限制性核酸内切酶切点，供外源DNA片段插入作为运载体必须具备哪些条件？1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3.具有某些标记基因，便于进行筛选。

如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。4.大小适中，便于操作。5.对宿主细胞无害、易分离。跟踪训练（2008年全国卷Ⅰ）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如下图中箭头所指。如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是A.3B.4C.9D.12C.三、基因工程的基本操作步骤1、目的基因的获得2、重组DNA的形成3、重组DNA导入受体细胞4、筛选含有目的基因的受体细胞5、目的基因的表达第一步：目的基因的获取1.目的基因是指：

编码蛋白质的基因

。2.原核基因采取直接分离法获得，真核基因是人工合成法。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)②反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA(cDNA)反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)③根据已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成获取目的基因的方法过程优点缺点直接分离法（鸟枪法）操作简便工作量大，有盲目性，目的基因含有不表达的内含子人工合成法反转录法专一性强，目的基因中不含内含子操作过程麻烦。mRNA生存时间短，技术要求高由氨基酸序列合成据推测出的核苷酸序列，通过化学方法合成

专一性最强，目的基因不含内含子，可合成自然界不存在的基因目前，复杂的尚不知核苷酸序列的基因不能合成mRNA单链DNA逆转录双链DNA合成供体细胞中DNADNA片段扩增限制性酶运载体DNA片段不同受体细胞目的基因细胞目的基因找出质粒DNA分子限制酶处理两个切口（位点）获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口(位点)两个黏性末端第二步：形成重组DNA分子用相同的限制核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA（如质粒），目的基因和载体DNA的两端形成相同的黏性末端，在DNA连接酶的作用下，将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。思考：1、用不同的限制核酸内切酶处理能否获得相同的的黏性末端？2、目的基因的插入能否会导致转基因生物出现致死现象？能，如限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，可形成相同的黏性末端。会，因为目的基因的插入，导致生物体生命活动必需的某些基因不能正常表达。第三步：将重组DNA导入受体细胞（也称宿主细胞）1、受体细胞的种类：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞植物：动物：可以是卵细胞（受精卵）、体细胞（可经组织培养为完整个体）受精卵（因体细胞的全能性受到限制）或用核移植后获得的重组细胞作为受体细胞原核细胞：作受体细胞时不能对分泌蛋白进行加工，可以考虑以酵母菌作为受体细胞（1）.将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法（2）.将目的基因导入动物细胞显微