低钙联合高蛋白饲料对大鼠松质骨与代谢的影响

低钙联合高蛋白饲料对大鼠松质骨与代谢的影响

核电站骨质疏松症是一种全身骨病，特征是骨量少、骨组织显微结构退化，导致骨脆弱性增加，骨折风险增加。营养和矿物盐对骨量的维持起重要作用,特别是其中的蛋白质及钙质。本研究通过检测骨生化指标、骨计量学和扫描电镜对低钙联合高动物蛋白作用于大鼠松质骨及代谢的影响进行初步探讨。骨小梁的检测动物与饲料清洁级健康雌性SD大鼠及饲料,由本校实验动物科学部提供。动物分组和实验方法3周龄SD大鼠20只,随机均分为2组,每组10只。实验组大鼠摄食为灭菌的低钙高蛋白饲料(Ca0.025%,protein27%),对照组为灭菌的标准饲料(Ca1%,protein18%)。连续喂养6月后处死。实验指标观测骨代谢生化指标每组实验结束时,在处死前24h代谢笼分别收取24h尿液,次日以采用5%氯胺酮腹腔麻醉后,摘眼球采血法留取血标本,离心取血清,-20℃冰箱保存待测,酶标法测定血清中的骨钙素(BGP)、骨源性碱性磷酸酶(BALP),尿样尿脱氧吡啶酚/肌酐(DPD/Cr),尿吡啶酚/肌酐(PYD/Cr)。单克隆抗体酶免疫试剂药盒由MetraBiosystems,Inc提供。骨形态计量学研究大鼠处死后立即取出L3椎体,去除附件及附着的软组织,放入丙酮溶液中固定24h。乙醇逐级脱水,每次24h,最后二甲苯透明4h,甲基丙烯酸甲酯包埋。在Polycut-s型硬组织切片机上切片,沿椎体中部冠状面切厚度为4μm的切片。甲苯胺蓝染色,参照Parfitt等骨小梁参数计量方法,借助Image-Pro-Plus图像分析系统进行测量。参数包括骨小梁面积百分数(Tb.Ar%),骨小梁厚度(Tb.Wi),骨小梁间距(Tb.Sp),小梁连结点数(N.Nd)和游离末端数(N.Tm)之比(NTR)。腰椎椎体显微结构的扫描电镜观察每组大鼠随机取L4椎体,沿矢状面纵向切开,注射器吸生理盐水冲洗剖面后,用2.5%的戊二醛溶液固定24h以上;后反复用0.1mmol/LPBS浮洗,10%次氯酸钠溶液处理6h,蒸馏水反复浮洗,50%、70%、90%、100%丙酮逐级脱水,50%、70%、90%、100%醋酸正戊酯逐级置换,临界点干燥仪干燥,离子溅射仪真空喷镀金膜,用JSM5600LV扫描电镜观察摄片(放大倍数为100和200倍)。统计学处理采用SPSS11.0统计软件进行统计运算,运用levenetest检验两样本方差齐性,根据方差齐性与否,分别采用t检验和校正t检验对结果进行显著性分析,所有参数均以x¯±sx¯±s表示。.05各升为基骨代谢生化指标从表1中可看出,实验组骨源性碱性磷酸酶与对照组无显著差异(P>0.05),骨钙素(P<0.01)、尿吡啶酚/肌酐(P<0.01)和尿脱氧吡啶酚/肌酐(P<0.05)升高最为明显。骨计量学参数从表2中可看出,实验组中骨小梁面积减少,骨小梁厚度出现显著变窄(P<0.01),、骨小梁结点末端比下降(P<0.05),骨小梁间距增宽但无统计学意义。扫描电镜超微结构实验组扫描电镜下形态学显示,骨小梁数目明显减少,纤细、稀疏,排列紊乱;有的骨小梁有吸收穿孔,断裂,骨髓腔扩大;小梁间距离增大,吸收孔大小不一、形状各异;一些骨小梁形成盲端游离于骨髓腔中,其立体网状结构受到破坏,骨的应力结构变差(图1A、B)。对照组骨小梁数目较多,骨小梁厚度较为均匀,形成立体的网状结构(图1C)。蛋白质饮食营养方面的骨代谢及流行病发生的影响骨质疏松的饮食危险因素包括钙摄入减少,维生素D不足,膳食中的钠、蛋白质、有机磷含量过高等。当钙摄入不足或钙吸收功能低下使机体缺钙时,可继发引起甲状旁腺激素(PTH)分泌增多,使骨吸收亢进。长期缺钙将导致骨量丢失,发生骨质疏松症。另外,有报道骨量与遗传、机械负荷、骨峰量值和营养内分泌状况等有关。从胎儿时期保持充足的钙摄入量,可以提高骨峰量值。骨峰量值增高,骨储备多,对中老年的骨量丢失缓冲能力强,使骨量减少保持在阈值以上,从而延缓或减轻骨质疏松的发生。大鼠在幼时钙摄入不足,其骨峰量值下降,而低骨峰量值使增龄后骨质疏松发生的风险大大增加。其次,有流行病调查报道,人群中蛋白质摄入量与骨密度显著负相关。高蛋白摄入使尿中代谢固定酸含量增加,肾近曲小管钙重吸收减少,尿钙增加,同时激发胰岛素与胰岛素生长因子对骨细胞调节作用。蛋白质摄入大多与磷结合,同时增加磷的吸收。后者能减少尿钙排泄,抵消高蛋白摄入引起的尿钙增加,但磷使钙从粪便中排泄量上升,所以过多的蛋白摄入的净效应是增加负钙平衡。本研究实验组饲料中蛋白质含量高并且钙质不足,二者同时作用于机体时,实验组大鼠出现骨小梁面积减少,骨小梁厚度显著变窄,骨小梁结点末端比下降,骨小梁间距增宽。电镜下骨小梁之间缺乏有效连接,骨小梁明显变薄、变细;骨小梁分离度加大,骨吸收的程度较深,发生穿孔,微裂纹和微骨折的微损伤明显增多,表现为与人类骨质疏松相似的病理变化,骨结构衰败。此必定会影响骨的力学性能,降低骨强度,加大骨折的危险性。骨代谢方面,DPD/Cr、PYD/Cr、BGP显著升高,提示破骨细胞活性增加,与之偶联的成骨细胞也功能活跃,骨转化率增加,骨重建的骨吸收大于骨形成,最终导致骨量减少。而BALP升高不明显其机制可能与全身骨转换速率不同,与不同部位骨丢失程度不同有关。因此,膳食中过多的蛋白质并且钙质不足会构成骨质疏松症的危险因素。本实验只在一个时间点上检测骨代谢的生化变化,有必要在骨质疏松不同阶段动态地检测其变化以阐明其变化规律。对骨小梁的形态学的研究也应在骨计量学上行动态观测,使骨重建的变化有直观、深入的理解。综上所述,根据本实验中骨计量学、代谢变化的情况,实验组大鼠属于高转换型骨质疏松,