大鼠神经源性膀胱后尿流动力学改变及c改变

大鼠神经源性膀胱后尿流动力学改变及c改变

神经源性膀胱（ngb）是临床上常见的膀胱功能障碍之一，也是脊柱损伤的常见原因之一。主要有两种类型:骶髓损伤(sacralcordinjury,SCI)和骶髓上损伤(suprasacralcordinjury,SSCI),骶髓损伤会导致逼尿肌无反射(detrusorareflexia,DA);而骶髓上损伤会导致逼尿肌反射亢进(detrusorhyperreflexia,DH)。但是引起逼尿肌亢进和无反射的发病机制目前一直存在争论。肌源性学说作为其主流学说之一,指出逼尿肌肌源性兴奋性增加是其重要的发病机制。而肌源性兴奋的快速传递是通过缝隙连接介导的,缝隙连接主要由连接蛋白组成,其中主要为Connexin43(Cx43),其表达的改变可反映缝隙连接的改变。2009年3月至2010年4月本实验通过免疫组化及Westernblotting检测Cx43在逼尿肌反射亢进和无反射膀胱中的表达变化,探讨Cx43与神经源性膀胱发病机制的关系。1材料和方法1.1动物分组及分组本实验共用成年健康SD雌性大鼠52只,随机分为对照组12只、骶上脊髓损伤组(DH组)20只、骶下脊髓损伤组(DA组)20只,购自于辽宁医学院动物中心。1.2脊突加研磨法骶上脊髓横断模型建立:10%水合氯醛(CH,0.03mL/kg)腹腔注射麻醉。以第13浮肋相连接的T13作为骨性标志,纵行切开背部皮肤约2cm,钝性分离皮下,尖刀片紧贴棘突骨面两侧行椎旁肌纵行切开,咬除L1-2椎板至横突根部,于L1-2处打开硬脊膜,以尖刀片自脊髓左侧至右侧快速划断脊髓,两断端之间填充明胶海绵,止血后依次关闭各层。手术后腹腔注射庆大霉素5000U/kg,1次/d,持续7d。骶髓损伤组钝性分离背肌后显露S1~S2,脊突和椎板。以椎板咬骨钳咬除L7~S1脊突和椎板。显露出硬脊膜后以眼科剪横断硬脊膜和脊髓,其他基本与骶髓上损伤组的处理相同。对照组不做让任何处理。手术后每只老鼠单笼饲养,采用Crede手法,于体表膀胱上方挤压膀胱协助排尿、排便,3次/d。1.3膀胱顺应性测试4周后实施尿流动力学检测:水合氯醛0.03mL/kg腹腔注射麻醉,经下腹部切开皮肤找到膀胱于膀胱顶部插入与测压导管相接的硬膜外导管,经三通管分别与尿动力仪及微量灌注泵相连,以0.2mL/min的冲水速度做充盈性膀胱测压,膀胱顺应性=灌注量/漏尿点压力。根据尿动结果,筛选出实验组DH及DA大鼠。1.4前卡式器官槽设计全切膀胱,立即放入4℃Kerb营养液中,取膀胱体部组织,纵行切成10mm×3mm×3mm肌条。取一根肌条,两端以丝线结扎,一端通过器官槽底部的小钩与微调螺旋相连,另一端与拉力传感器感应头相连。器官槽内充满37℃恒温的Kerb液,液体中通以95%O2和5%CO2混合气体。设置记录软件参数,具体参数为:张力模式,扫描速度10s/div,灵敏度0.75g,时间常数直流。采集频率400Hz,滤波频率30Hz。进行以下试验。1.4.1逼尿肌的收缩先使肌条处于完全放松的无张力状态,调节微调螺栓旋,逐渐缓慢牵拉肌条直至其出现收缩,记录使逼尿肌出现收缩时的最小张力,此张力的大小反映逼尿肌对可兴奋刺激的阈值。1.4.2检测一定的负荷压力下迫使尿肌收缩的频率调节微螺旋,牵拉肌条至张力为1.25g时固定肌条长度,检测逼尿肌的收缩频率,频率越高反映逼尿肌的兴奋性越高。1.5免疫组化1.5.1试剂Cx43一抗(多克隆兔抗鼠),二抗(多克隆羊抗兔),DAB显色液,均购于武汉博士德生物工程有限公司。1.5.2方法标本经石蜡切片厚5μm。免疫组化方法采用SP方法。Cx43一抗浓度1:100,DAB显色,苏木素复染。1.6免疫组化处理取冷冻膀胱标本抽提总蛋白,测定浓度后-70℃冻存备用。先后灌制十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺分离胶和积层胶,加电泳缓冲液后,加样,电泳完毕后将蛋白转印于硝酸纤维素膜上,脱脂奶粉封闭膜后加入兔抗Cx43多克隆抗体,4℃过夜;洗膜,加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG,洗膜后加入DAB显色。蛋白的检测均以PBS替代一抗作为阴性对照,以内参(β-actin)作为阳性对照。1.7统计方法采用SPSS13.0统计软件,均数比较采用t检验,各参数间相关性分析使用Spearman相关分析。2结果2.1死亡率DH组死亡4只,DA组死亡6只,推测原因可能为术后感染,术后尿潴留,术后肠梗阻所致。2.23两组逼尿肌漏尿点压情况比较DH组逼尿肌漏尿点压较对照组、DA组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),DA组逼尿肌漏尿点压较对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.01);DH组膀胱最大容量、膀胱顺应性较对照组、DA组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),DA组膀胱最大容最、膀胱顺应性较对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),见表1。2.3不同组的下蹲和收缩能力，以表示收缩的最小张力比率牵拉逼尿肌致其出现收缩时的最小张力DH组明显低于对照组和DA组;前负荷为1.25g时DH组的收缩频率明显高于对照组和DA组,见表2。2.4两组阳性表达位整合体的比较DH组Cx43表达增强,各组逼尿肌均有Cx43阳性表达,对照组、DH组和DA组阳性表达位点数分别为16.2±1.68、23.5±1.44和12.6±1.28,DH组较对照组及DA组明显增多,差异有显著性(P<0.05)。2.5两组逼尿肌组织cx33蛋白表达情况比较对照组逼尿肌组织少量Cx43蛋白表达,DA组有低水平的表达,DH组逼尿肌组织Cx43蛋白与其他各组相比较表达有较明显增加,差异有显著性(P<0.01)。见图1。3神经源性脏器dh的兴坚性脊髓损伤后神经源性膀胱功能障碍发生的病理生理过程非常复杂,不能仅依靠临床开展系统研究,因此,通过建立动物模型进行实验研究就显得特别重要。一直以来,围绕导致膀胱功能障碍的原因是神经源性还是肌源性的争议就没有停止过,以DeGroat为代表的神经源性学说认为,所有逼尿肌兴奋性的改变均源于神经因素,或为神经因素的延续效应,主要是表现在神经受体的数量和功能的上调。而以Brading为代表肌源性学说则认为兴奋性改变除神经因素作用外,尚有肌源性异常因素参与,包括逼尿肌细胞的兴奋性增高、细胞间信号传导功能的加强、逼尿肌细胞与神经节细胞的联系增加等。以往多从神经角度探讨其发生机制,而对神经病变后逼尿肌发生的继发性改变与DH之间的关系研究较少。本实验通过检测离体逼尿肌条兴奋性发现,离体逼尿肌条机械牵拉致其出现收缩时的最小张力在DH组明显低于对照组和DA组,相同的前负荷下DH组收缩频率明显高于DA组和对照组,说明骶髓上损伤后DH逼尿肌兴奋的阈值降低,兴奋性增强,DH的发生与神经病变后逼尿肌自身的兴奋性增强密切相关。缝隙连接是逼尿肌细胞间的兴奋传导通道,通过实验看出骶髓上损伤后DH逼尿肌细胞中Cx43表达增加,Cx43增加可能导致离子和带电小分子可迅速通过连接通道,使相邻细胞膜发生去极化,形成广泛的电耦联,细胞间电传导易化,造成局部细胞的电活动很容易传递到整个膀胱,因此在无主观控制的条件下发生膀胱无抑制收缩。另外,膀胱的神经支配特点是一个神经末梢支配多个逼尿肌细胞,并非每个逼尿肌细胞都有神经支配,就单个逼尿肌细胞而言,当其兴奋后通过兴奋收缩耦联即可产生收缩反应,但DH是整个膀胱组织收缩,当一次兴奋启动后必须经过特殊