鱼腥草注射液抗炎和绝热作用的实验研究

鱼腥草注射液抗炎和绝热作用的实验研究

鱼粪草注射液作为一种广泛使用的中药方剂，具有清热解毒、消脓、排脓、补水通淋的功效。临床上主要用于呼吸道感染、尿道感染、妇科感染等疾病的综合治疗。随着该药的广泛应用,其严重不良反应,如过敏性休克、死亡,引起了各界高度重视,已被暂停生产、使用。本课题组前期进行的豚鼠、Beagle犬和食蟹猴的类过敏和过敏试验中均发现鱼腥草注射液原制剂所含增溶剂聚山梨酯80(polysorbate80,Tween80)具有致敏性。经过大量文献调研和增溶剂优选试验研究,选用新增溶剂羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD),通过对鱼腥草原料药、中间产物及中试产品的全程质量控制,改进生产工艺及质量标准,研制成鱼腥草注射液新制剂。前期进行的Beagle犬和食蟹猴类过敏和过敏试验结果显示新制剂无明显致敏性,解决了鱼腥草注射液的主要安全性问题。本研究在以往工作的基础上,进一步研究NYI的抗炎、解热作用及其影响因子,并与OYI作用进行比较,现报道如下。材料表面1大耳白兔1ICR小鼠300只,SPF级;SD大鼠100只,体重160～190g;日本大耳白兔90只,体重为2～2.5kg,以上实验动物均为雄性,均由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号:SCXK(京)2007-0001。实验环境室温度10～16℃,相对湿度为40%～55%。2注射用赖氨匹林氢化可的松注射液(规格:5mL∶25mg,天津金耀氨基酸有限公司,批号:0612212,);注射用赖氨匹林(规格:0.9g·瓶-1,安徽丰原药业股份有限公司涂山药厂,批号:080109);鱼腥草注射液原制剂(OYI):含0.5%Tween80,批号为K080501;鱼腥草注射液新制剂(NYI):含0.4%HP-β-CD,批号为K080907,均由四川雅安三九制药集团提供。3酶标仪8mm打孔器(东莞市长安巨丰五金制品厂);电子天平10d(北京赛多利斯仪器系统有限公司);UV8453型分光光度计(美国Agilent公司);IECCL31R离心机(美国ThermoFisherScientific公司);MC141W型OMRON电子体温计(大连欧姆龙有限公司);HERMOMULTISKANMK3全自动酶标仪(美国热电公司)。二甲苯(分析纯,规格为500mL·瓶-1,批号:9004261,北京五二九五二化工厂生产);伊文思蓝(规格:1g·瓶-1,批号:E2129,货号:E8010,Sigma公司生产);冰醋酸(500mL·瓶-1,批号:20081107,北京试剂厂生产);干酵母片(规格为每袋0.2g×80片,批号:0812023,广东五洲药业有限公司);大肠杆菌内毒素(LPS055∶B5,批号:L2880,Sigma公司生产)。RabbitPGE2ELISA试剂盒,96T,货号:5B640;RabbitELISAIL-1β试剂盒,96T,货号:5R034;RabbitIL-8ELISA试剂盒,96T,货号:5R044;RabbitTNF-αELISA试剂盒,96T,货号:5R022,均购自Sunbio公司,美国RB(Rapidbio)公司分装。方法1小鼠右耳正反两面致炎试验雄性ICR小鼠180只,体重为27～30g,随机分为6组:模型对照组,氢化可的松组(25mg·kg-1),OYI组(30mL·kg-1),NYI高剂量组(NYI-H组,30mL·kg-1),中剂量组(NYI-M组,15mL·kg-1)和低剂量组(NYI-L组,7.5mL·kg-1),每组30只。将0.025mL二甲苯均匀涂于小鼠右耳正反两面致炎,左耳不涂,为正常耳。造模后立即静脉注射各剂量药物,给药后1.5h脱颈处死小鼠,沿耳廓基线剪下两耳,用8mm打孔器冲下左耳和右耳同一部位的圆片,于电子天平上称重,以左右两耳重量差表示肿胀度,并计算肿胀率和肿胀抑制率。2透气性抑制率测定雄性ICR小鼠100只,体重为18～21g,分组及给药剂量同“1”项,每组16只。静脉给药后30min,尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液(0.1mL/10g体重),腹腔注射0.8%乙酸生理盐水溶液(0.1mL/10g体重),30min后,断颈处死,剪开腹膜,用8mL生理盐水冲洗腹腔,收集洗液,4℃,2500r·min-1离心10min,取上清液于590nm处测定吸光度值(A),增加并计算通透性抑制率(%)。3动物分组、模型被试和模型处理雄性SD大鼠100只,体重160～190g,每日测肛温1次,连续3d,使大鼠适应此测温操作。选择体温范围在37.0～38.0℃,且体温波动在0.5℃以内的84只大鼠用于实验。随机分为7组,分别为正常对照组、模型对照组、赖氨匹林注射液组(200mg·kg-1),OYI组(20mL·kg-1),NYI高剂量组(NYI-H组,20mL·kg-1)、中剂量组(NYI-M组,10mL·kg-1)和低剂量组(NYI-L组,5mL·kg-1),每组12只。实验当日早晨先测动物基础体温,然后以15%的酵母混悬液按1mL/100g背部皮下注射复制发热模型。造摸后3h,各给药组分别静脉给药1次,模型组在同等条件下给予同体积生理盐水。在复制发热模型后2,3,4,6,8,10h及给药后即刻,1,3,5,7h测量肛温(造模3,4,6,8,10h与药后即刻,1,3,5,7h为重合时间点),以不同时间所测肛温与各基础肛温的差值为体温变化的指标。4家兔进行内毒素检测,造模方法及过程日本大耳白兔90只,实验前3d预测体温,体温在38.0～39.0℃,波动在0.4℃以内者为合格家兔,连续3d测得的肛温值为基础肛温。将77只合格家兔按体重分层,随机分为7组,分别为正常对照组、模型对照组、赖氨匹林组(180mg·kg-1),OYI组(10mL·kg-1),NYI高剂量组(NYI-H组,10mL·kg-1)、中剂量组(NYI-M组,5mL·kg-1)和低剂量组(NYI-L组,2.5mL·kg-1),每组11只。实验日测定家兔体温后,各家兔耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素(LPS)0.5μg·mL-1(1mL·kg-1),正常对照组则注入等剂量无菌生理盐水,全部过程均无菌操作。造模后立即耳静脉注射给药。给药后0.5,1,2,3,4,5,6h测家兔体温。连续观察药后各时段体温变化值。于造模后2h,从清醒家兔耳缘中动脉抽血3mL,放置1～2h后,4℃,3000r·min-1离心10min,取血清,-20℃保存。采用双抗夹心ELISA法,参照试剂盒说明书测定IL-1β,IL-8,TNF-α,PGE2含量。5统计方法数据采用ˉx±s和百分率表示,应用SPSS13.0统计软件,采用单因素方差分析进行组间差异性比较。P<0.05为有统计学意义。结果1高、中剂量niii对niii表达的抑制作用NYI的高、中剂量对二甲苯诱发小鼠耳肿胀均有抑制作用。高、中剂量NYI与模型对照组相比有显著性统计学差异(P<0.05)。与OYI相比,NYI组的抑制耳肿胀作用无明显差异。见表1。2niii对k-l-i表达的影响NYI的高、中、低剂量组对醋酸导致的小鼠腹腔毛细血管通透性亢进均有抑制作用。其中高、中、低剂量与模型对照组相比均有显著差异。与OYI相比,NYI的抑制腹腔通透性的作用较强,但二者抑制作用无明显差异。NYI和OYI对乙酸导致的小鼠腹腔毛细血管通透性亢进影响的比较结果见表2。3造模前后动物体温的变化各组大鼠在造模后1～2h,体温明显地低于基础体温,此后逐渐回升。造摸后3h,各组动物体温上升幅度稳定均一,故决定造模后3h尾静脉注射给药。模型组动物3～6h体温显著升高,6h达到高峰,此后体温逐渐平缓下降。结果显示,NYI高剂量组在给药后1～3h出现明显的降低体温作用,与OYI相比无显著性差异。见表3。4内毒素对蚕桑发烧的影响4.1第3h左右稳定各组动物在造模后体温即开始上升,至1～2h左右达到高峰,此后体温稳定与此,至第3h左右再度升高且超过第一个体温高峰,此后逐渐下降。结果显示,OYI有显著的解热作用(P<0.01),NYI高剂量也有明显抑制体温升高的作用(P<0.05),两者相比无显著性差异。见表4。4.2ooi和高剂量niii对il-8和pge2含量的影响结果显示,与正常对照组相比,模型组的血清中TNF-α,IL-1β,IL-8和PGE2的含量显著增加(P<0.01)。OYI和高剂量NYI均能明显降低TNF-α,IL-1β,IL-8,PGE2的含量。与模型对照组比较,均有显著性统计学差异(P<0.05),两者比较无显著性差异。见表5。鱼腥草制剂的药效学作用鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜(HouttuyniacordataThunb)的全草,具有清热解毒、消肿排脓、利尿涌淋的功效,主要应用于治疗肺痈吐脓、痰热喘咳、热痢热淋、痛肿疮毒等病证。鱼腥草中主要含有挥发油和黄酮类化合物。从鱼腥草中提取的精油中分离出抗菌活性的成分癸酰乙醛(decanoylacetaldehyde)与月桂醛(laurinaldehyde)均有特异臭气味。曾虹燕等认为水蒸气蒸馏所得的挥发油化学成分种类最多,其主要成分为甲基正壬酮、1-壬醇、癸醛、芳樟醇、癸酸等,其中甲基正壬酮含量占了近1/4,其他成分的相对含量较少。水蒸气蒸馏的鱼腥草挥发油不具腥味,不含癸酰乙醛,可能在加热条件下,癸酰乙醛被氧化为癸酰乙酸,后者极易降解为甲基正壬酮。采摘鲜鱼腥草24h内,采用水蒸气重蒸馏法制备NYI,经气相色谱-质谱联用对其成分进行鉴定,结果显示,主要含有2-甲基正壬酮、芳樟醇、萜品醇、(-)-冰片醋酸酯、癸酸等39种成分,其中以芳樟醇、4-萜品醇、α-萜品醇、(-)-冰片醋酸酯、2-甲基正壬酮、癸酸等6种成分含量相对较高,占提取总挥发油含量的70%。其中,2-甲基正壬酮、芳樟醇、冰片L、萜品醇具有抗菌、抗病毒作用;萜品醇还具有平喘止咳作用;香叶醇具有抗菌和提高机体免疫力作用。本实验室近期进行了NYI和OYI的抗病毒作用比较研究,主要采用甲型H1N1流感病毒FM1和PR8株体内感染小鼠和免疫低下小鼠肺炎模型、体外细胞病变效应(CPE)法和神经氨酸酶荧光测定法、病毒载量检测和小鼠死亡保护4个实验。结果显示,鱼腥草注射剂对流感病毒株FM1和PR8感染引起的小鼠肺部炎症均有明显治疗和预防作用,降低H1N1病毒感染小鼠的肺指数和肺组织病毒载量,并能显著降低肺炎小鼠的死亡率,增加小鼠的存活天数。同等剂量下,二者作用相当。NYI和OYI对所试两株病毒致CPE均未显示出抑制作用,对流感病毒FM1株神经氨酸酶活力未显示出抑制作用。结合本研究结果,我们认为中药治疗感染性疾患,强调通过“扶正”达到“祛邪”,即通过调整机体抗病能力(免疫、抗炎等多方面作用),而达到抑菌、抗病毒、缓解症状、促进康复等治疗作用,因而在实验研究中,经常是体内实验有效,而体外实验效果欠佳或无效。这符合中药研究中的普遍性规律,值得进一步研究,特别是通过临床研究来获得可靠的结论。LPS作用于人体和动物,可以使单核-巨噬细胞释放内源性致热源TNF-α,IL-1等,TNF-α通过直接刺激下丘脑体温调节中枢和刺激巨噬细胞释放IL-1,IL-1促进单核-巨噬细胞释放PGE2(发热的正调节介质),刺激下丘脑体温调节中枢,引起发热。IL-1,TNF和LPS均能诱导单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞合成和分泌IL-8。IL-8水平升高往往与局部浸润的单核细胞和中性粒细胞数量相平行。在发热和感染模型的早期血清或炎症局部渗出液中都可检测到IL-1,I