新月外源基因导入研究进展

新月外源基因导入研究进展

玫瑰是世界上最重要的观赏植物之一。月季育种的目标主要集中在对花色、花香、花形、开花习性、鲜切花寿命、株型、抗病性等的改良上,在花卉育种中更受关注。由于月季基因资源有限、缺乏纯系以及由倍性和染色体数目差异造成的高度不亲和性,因而传统的方法存在着一定的局限性。基因工程技术因能保持品种其它性状的相对稳定,只在外源基因所控制的性状上发生改变,并能利用来自其它生物类型的基因,从而为月季品种改良提供了新途径。而通过体细胞进行月季组织培养和建立遗传转化体系是基因工程育种的重要基础工作。本文就近年来在这方面的研究进展进行综合回顾,为月季基因工程改良研究提供参考。1植株再生过程为了进行基因转化、突变育种、快速繁殖和品种保存,必须建立植株的再生系统。1967年Hill首次报道月季的组培再生器官研究,随后又有多篇论文报道:在‘Soraya’、‘Baccara’等品种上实现了通过体细胞胚状体发生和器官发生途径再生完整植株直至开花。Rout等对国外近年来月季生物技术的研究成果进行了概述,但相关报道在国内极少见到。植株的再生一般经历从愈伤诱导、愈伤分化(体细胞胚状体发生或器官发生)、胚状体成熟萌发或芽的发育、到植株再生、完整植株的移植等步骤。下面将从影响植株快繁、愈伤诱导、体细胞胚状体和器官发生、植株再生等方面阐述月季的组织培养研究进展。1.1培养基的性质对小芽增殖的影响以往月季的繁殖方式主要靠嫁接、扦插和压条等,繁殖系数低,远远满足不了市场的需要。1970年,Elliott首次在聚花月季(Rosamultiflora)上成功地进行了芽的繁殖和诱导幼苗生根。1976年,Zieslin等报道细胞分裂素有利于提高丛生芽的数量,但也增加了诱发花器官败育或退化的频率。而Bressan研究发现,采用6-BA质量浓度为0.03～0.3mg/L的MS培养基时可促进“GoldGlow”侧芽的发育,但当BA质量浓度超过0.3mg/L则显著推迟芽萌发,毕艳娟也报道了低浓度的细胞分裂素(BA、ZT)有利于提高月季的萌芽率。不同种类的细胞分裂素对月季茎增殖的影响也不同。Marcelis等在添加相同浓度(0.44μmol·L-1)的细胞分裂素BA、ZTKT、ZR、2iP、ipA研究结果表明,KT实际上对茎增殖没有多少影响;而BA、ZT、ZR都可显著促进茎的重量和长度增加;2iP和ipA虽也可促进茎的形成,但效果不如BA、ZT、ZR的明显。细胞分裂素配合一定的生长素可共同促进月季侧芽的萌发与生长,最常用的是NAA。在6-BA质量浓度相同的情况下,随NAA质量浓度的升高(0.05～0.20mg/L)月季小芽生长速度加快。但NAA用量同时会影响芽增殖速度,当NAA用量达0.1mg/L以上时,芽增殖的速度有下降趋势。培养基中添加蔗糖有增加丛芽数量的作用,加入低浓度的GA3能进一步改善芽繁殖,95%的外植体能产生7个以上的小芽。移植植株生长均一,保留母本的优良性状。Martin等调查了2125个无菌苗3年间在大田生长的情况,没有发现变异植株,说明通过侧芽方式繁殖的植株性状很稳定。1.2生长素种类及浓度对愈伤产生能力的影响1967年Hill最早报道从杂交茶香月季(R.hybridcv.Tearose)的茎上诱导了愈伤组织,但实验结果只到芽原基(shootprimordial)。该实验证明在培养基中添加2,4-D或添加NAA和激动素(kinetin,Kin)均能很快诱导出愈伤组织。Lloyd等曾研究R.persica×xanthina、R.hybridacv.‘Clarissa’、R.hybridacv.‘DameofSark’和R.rugosacv.‘Scabrosa’的愈伤发生能力,发现只有R.persica×xanthina的节间能产生愈伤,愈伤组织脆性,呈淡黄绿色,该实验是以MS为基本培养基,添加低浓度的BAP和NAA。表明月季愈伤组织的诱导与其品种的基因型有关。激素、糖和外植体类型也是影响愈伤生成的重要因素。Rout等以‘Landora’为材料,在添加BA和NAA、2,4-D的MS培养基上,叶外植体在接种7～12d后,在近轴面的叶柄和中脉处产生愈伤,愈伤组织诱导频率高达92%;茎外植体在接种15～20d,切端处产生愈伤,频率为76%。生长素种类和浓度对愈伤产生能力的影响同样很大。早期实验多采用NAA结合BAP或BA等,近年来多采用2,4-D,2,4-D对愈伤的诱导效果因月季的基因型不同而异,如2,4-D浓度从11.3μmol/L增加到181μmol/L,降低了R.hybrida栽培种“CarefreeBeauty”的愈伤诱导频率,但该浓度则对另一个品种“GrandGala”无影响。VanderSalm等证明2,4-D对诱导R.persica×xanthina和‘Moneyway’产生愈伤是非常必要的,进一步添加低浓度的BAP有正效应,但如果BAP浓度过高,则产生抑制作用。表明2,4-D是诱导愈伤组织的必要因素。1.3细胞胚发诱导成功的体细胞胚状体发生体系的建立将有助于月季的试管苗快繁、冷藏保存、人工种子的生产和基因的转化操作等等。1987年Valles和Boxus首次从体细胞胚状体得到再生植株。多年的研究证明体细胞胚状体的发生是月季微繁殖潜在的非常有效的方法。体细胞胚再生的基本培养基有MS、1/2MS、B5、SH等。培养基中的微量元素若除去Mg2+、Zn2+、I-或是降低三者的浓度或是提高Cu2+浓度10倍,有利于愈伤形成和体细胞胚诱导。但是在体细胞胚发芽时,Cu2+浓度的提高对发芽不利。Murali等调查22个品种发现,只有2个品种能进行体细胞胚状体的发生诱导。deWit等也发现在供试的7个品种中,只有‘Domingo’和‘VictoryBrown’具有产生体细胞胚状体的能力,表明月季的体细胞胚状体发生能力与基因型的关系密切。因此,至今为止,还没有一种单独的方案可以诱导出多倍体月季基因型体细胞胚。Kintzios等认为,培养时的光照强度对体胚的形成影响很大,光强低于50μmol·m-2·s-1光照条件体胚的发生频率最高。绝大多数进行体细胞胚的诱导实验都是在培养基中添加细胞分裂素(BA、BAP、Zeatin或Kin)和生长素(2,4-D、NAA)。Kintzios等则证明在供试材料上使用NAA、BA和GA3对诱导产生体细胞胚状体无效,CPA才是诱导体细胞胚状体的决定因素。以上结果表明月季的体细胞胚状体发生能力也因品种以及外植体的类型随激素类型和浓度不同而有所变化。1.4分离芽的诱导月季的芽器官(shoot)发生表现为两种类型:一类直接起源于外植体,不需经过愈伤组织阶段;而另一类需要经历愈伤阶段的过程。1967年,Hill首次报道从愈伤组织再生了芽原基,但最终未能得到真正的芽,以后Tweddle等和Llody等分别报道R.persica×xanthina的愈伤组织在含BA和NAA的MS培养基中能再生不定芽,Arene等证明在MS培养基中添加BAP也能诱导愈伤组织分化芽。而Rosu等则以增殖的无菌丛生芽为外植体,在含BA和NAA的培养基上直接再生了芽,当这些不定芽移至含NAA、GA3和硝酸银的培养基中,能诱导出丛生芽。另外,Ishioka和Tanimoto证明,在MS培养基中只添加硝酸铵,70%的外植体产生不定芽。Rout等报道GA3和adeninesulfate加速了再生芽的产生。表明以茎为外植体可能更适合于进行芽器官再生的诱导。1.5植株的变异一般无菌苗移植到室外的成活率达80%以上。通过芽快繁途径得到的植株或不经愈伤阶段直接起源于叶、根的植株,生长情况与对照相同,无变异发生。相反,来源于营养器官的愈伤组织再生的植株存在着21.7%的变异,外植体若为合子胚的,再生植株的变异率高达70%,变异性状体现在花瓣的数量、形状和颜色以及植株的生长高度上。VanderSalm等对13个再生植株的研究,发现其中12株的倍性与对照一致都是二倍体,但其中有1株的叶色变为嵌合色,六倍体变异率为1/13。表明由营养器官愈伤组织再生得到的植株大多有变异现象。2胚性愈伤组织的基因结构及转化高效的植株再生体系是遗传转化成功与否的重要前提条件。目前,已有许多月季品种通过器官发生和体细胞胚发生途径成功地获得再生植株,但关于月季遗传转化的报道还不多,除VanderSalm等采用不定根作为转化受体外,其它所有转化系统都采用了胚性愈伤组织或体细胞胚[30.31]进行转化。1991年Firoozababy等首次成功地进行了农杆菌介导的月季转化。他们以R.hybridacv.Royalty为供试材料,将其胚性愈伤与含有pnosNPTⅡ/p35SLUC质粒的致瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404或与含有pnosNPTⅡ/p35SGUS质粒的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenesis)15834共培养,得到了很高转化愈伤频率,即每克愈伤约产生40～60个独立的抗卡那霉素愈伤,通过LUC或GUS和PCR技术检测,几乎100%的抗性愈伤为转化体。次级体细胞胚和胚性愈伤组织因能长期保存,不断提供丰富的材料,而且再生能力持久,成为目前主要的受体材料,之后通过抗性体细胞胚或胚性愈伤组织的再生获得转化植株。唯一例外的是VanderSalm等采用R.hybridacv.Moneyway节间组织与农杆菌在诱根培养基上共培养,得到转化的不定根,再经12个月从转化的不定根上诱导出胚状体,最终长成植株。农杆菌菌株及质粒种类对转化影响不大,根癌农杆菌LBA4404或发根农杆菌15834的转化效率无显著差异,根癌农杆菌GV3101、EHA105和GV2260也都有成功报道,但农杆菌的预培养及共培养时间对转化效率有一定影响。Dohm等报道使用根癌农杆菌EHA105和GV2260时,摇菌时间不应超过2h,共培养时间分别为2d和6d。共培养的结果得到再生的转基因植株。2004年,Kim等将绿色荧光蛋白基因运用农杆菌介导法成功转化月季,并得到Southern杂交分析验证。以上结果表明农杆菌菌株及质粒种类对转化影响不大,但农杆菌的预培养及共培养时间对转化效率有一定影响。除农杆菌介导法外,基因枪法也被应用于月季的转化。影响月季基因枪法遗传转化的因素有:发放距离(终止屏和目标组织之间的距离)、裂盘压力、调节渗透压的渗透物质以及渗透物加入的时间等。Marchant等研究指出当发放距离为70mm时,GUS检测达到最高,而当发放距离大于100mm时未检测到GUS表达。当裂盘压力为9000kPa时GUS表达最高。3种渗透物质肌醇、山梨醇(含甘露醇)、蔗糖的比较表明,于EP培养基中加肌醇0.25mol/L,GUS表达量高于轰击后48h加2倍的肌醇。在轰击前4h加肌醇和轰击后24h加肌醇最有利于基因的转入。Marchant等指出转入的片段整合到月季基因组的位置对转基因植株基因表达的影响比转入片段数目的影响更重要。Marchant等以胚性愈伤组织细胞为对象,通过转化GUS报告基因,将基因枪法的转化条件进行了优化。同年,Marchant等利用基因枪法成功地将几丁质酶基因导入月季,减少黑斑病发生率13%～43%。利用基因枪法成功转化月季关键是携带DNA的微粒有效穿入目标组织。月季遗传转化中PEG介导法也广泛应用。影响PEG介导法的因素有原生质体分离所用的复合物、植物材料来源和基因型、细胞悬浮预培养条件、外源DNA等。Schum等研究了影响月季原生质体分离和转基因植株再生的因素,结果表明1.5%纤维溶素,0.5%粗制纤维素酶和0.5%解析酶的复合物,分离不同月季基因型离体培养的芽和愈伤组织、非胚发生和胚发生的悬浮培养细胞中的原生质体效率最高,原生质体的产量很大程度上取决于材料来源和基因型,从叶肉提取原生质体可降低体细胞自身变异对基因转化的影响。多数情况下,非胚及胚发生的细胞悬浮培养物是分离原生质体的优选材料。特殊的预培养条件,如培养基中生长素的类型,悬浮生长周期中的合适阶段,材料培育中的光照条件,都是成活的原生质体获得高且一致的萌发率所不可缺少的。3对转化条件的优化月