人类基因组(下)

（三）DNA多态性与个性化医疗在现代医学发展史上，人们大致经历了三次革命。第一次医学革命主要是发现和描述疾病，并试图用现代科学来解释、查明疾病的病因；第二次医学革命是探明疾病发生的分子机理，即采用生物化学、生物物理等一系列新兴学科知识，从分子水平上揭示疾病的起因，并由此开发出针对某一类疾患的特效药，我们今天仍处于这一革命的高峰。第三次医学革命是1990年代中期出现的医学个性化医疗的新趋向。1随着分子生物学，特别是人类基因组研究的不断深化，人们认识到疾病的发生、发展往往与患者特定的遗传背景有关。为此，在今后的疾病诊断和治疗中，医生将更多考虑患者的遗传背景。研究遗传、环境因素对人体健康的影响－疾病易感性2个体对环境致病因素的易感性有着很大的差异，因此患病的概率也不同统计数字表明，中国人患肝癌的比例大大高于其他种族，即使移居海外已经几代的华人，其患肝癌的比例仍明显高于其他民族人群。反过来，白人中皮肤癌的罹患率相当高，而中国这一病症的发生率则低到可以忽略不计。日本是胃癌高发区：Japanese:1.00BorninJapan:0.72BorninUSA:0.38USwhites:0.173正常人体细胞中有癌基因和抑癌基因。癌基因对维持细胞正常生理功能是必需的。当癌基因突变激活或抑癌基因突变失活，就会引发肿瘤。化学诱变剂和辐射会损伤DNA，使癌基因和抑癌基因发生突变。4细胞中有一部分代谢酶灭活诱变剂，由于遗传变异，有的人这部分代谢酶活性低，就较易得肿瘤，编码这部分活性低的代谢酶基因就成为肿瘤易感基因；相反，有的诱变剂需另一部分代谢酶活化，编码这部分活性高的代谢酶基因就成为肿瘤易感基因；细胞中有一系列修复DNA损伤的酶，编码活性低的修复酶基因，就成为肿瘤易感基因。5因此，肿瘤的发生就和许多编码代谢酶、DNA损伤修复酶的基因有关，还和环境化学、物理因素有关，为多基因病。例如对于某种肿瘤，与其发生相关的基因有许多（代谢酶基因、DNA损伤修复基因），SNP也有许多，根据大量的文献报道，进行综合分析，选取差异显著的一些SNP位点进行检测，就可以作出风险评估。6个体对药物的敏感度－个体化用药目前，正在兴起的药物基因组学研究遗传因素对药物作用的影响和不同基因型个体对药物反应的差异，从而为临床有针对性地合理用药，及根据不同基因型群体对药物的反应来改进药物设计提供了理论依据，促进了个体化用药的进程。伊立替康（irinotecan）是治疗结直肠癌的化疗药，由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT1A1）代谢。伊立替康有严重的副作用：白细胞减少和严重腹泻。72005年8月美国FDA批准第一例通过检测UGT1A1多态指导伊立替康剂量。UGT1A1野生型在启动子TATAbox区域6个TA重复，变异体UGT1A1*28是7个TA重复，导致活性降低。硝酸甘油是治疗心绞痛的特效药。线粒体醛脱氢酶2（ALDH2）负责NO的形成，而后者是硝酸甘油发挥作用所必需的。ALDH2第12个外显子在中国人中存在G→A多态，导致第508位氨基酸由谷氨酸变成赖氨酸，而使ALDH2失效。研究表明，在80个中国病人中，有21个对硝酸甘油无效。8Gefitinib（吉非替尼），商品名：Iressa（易瑞沙），生产公司：AstraZeneca（阿斯利康）在人类多种上皮细胞源性的肿瘤组织中都存在EGFR（表皮生长因子受体）的异常激活，使其正常功能失控，从而引起细胞异常增生和转移。已知多种实体瘤，如非小细胞肺癌（NSCLC）和头颈癌、结肠癌、乳腺癌等的发生都与肿瘤组织中EGFR的异常活化有关。Gefitinib抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶（EGFR-TK）活性，截断EGFR生成信号传递至细胞内，从而遏止细胞的异常增生和转移，起到抗肿瘤作用。

Gefitinib只对表皮生长因子受体基因突变肿瘤有效。9非小细胞肺癌（NSCLC）中研究表明：突变在腺癌中比其它NSCLC中频率高（15/70or21％vs1/49or2％）；在女性中比男性中频率高（9/45or20％vs7/74or9％）；在日本患者中比美国患者中频率高（15/58or26％，腺癌中14/41or32％vs1/61or2％，腺癌中1/29or3％）。在日本女性腺癌患者中基因突变频率最高（8/14or57％）。10两年前，西班牙已在临床上试验性推广个性化治疗，采用的也是基因技术西班牙妇女玛尔塔和罗莎同时被诊断出患了乳腺癌，经过治疗病情得到控制。但是医生给她们使用了不同的药物。玛尔塔用的药物叫Trastuzumab，重组DNA人单克隆抗体。而罗莎使用的是Gefitinib，一种专门用来治疗顽固性家族遗传乳腺癌的药物。她们两人患上乳腺癌的病因完全不同，因而医生针对其各自病情采用了不同的药物。对玛尔塔和罗莎来说，医生治愈的不是“通常”的癌症，而是属于“她们”自己的癌症。11目前已知人类表皮生长因子受体－2（HER－2）是目前认识较为清楚的与乳腺癌关系密切的人类癌基因，它在乳腺癌中的高表达往往预示着雌激素受体（ER）阴性、易有淋巴结转移和肿瘤分化差，预后不佳。随着对HER－2研究的深入，它已经成为乳腺癌特异性治疗的靶分子之一。12已被FDA批准的曲妥珠单抗（Trastuzumab）是重组DNA人单克隆抗体。曲妥珠单抗选择性作用于HER－2，具有高度亲和力，具有高度靶向性，只对癌细胞起作用，而对正常细胞的杀伤较小，是当代乳腺癌靶向治疗的代表性药物。13基础研究表明，约有25％～30％的乳腺癌患者HER－2有基因改变，促使肿瘤细胞HER－2增加。曲妥珠单抗可选择性地与HER－2牢固结合，抑制癌细胞的增生，适用于HER－2过度表达的乳腺癌患者。141、功能克隆：

（四）疾病相关基因的定位与克隆从疾病出发，鉴定功能蛋白质，从蛋白质再鉴定、克隆致病基因的方法，称为功能克隆。克隆（致病）基因的一种策略。收集所要克隆的基因的蛋白质产物及其功能的信息，用以分离基因，并对基因进行定位。15性状（疾病）蛋白质产物（生物学功能）从氨基酸序列出发设计DNA引物，从文库调取基因得到基因序列染色体定位疾病基因功能分析异常基因的产物（蛋白质），纯化蛋白质，进行氨基酸序列测定，据此推测可能的核苷酸序列，合成寡核苷酸探针，然后用探针从cDNA文库中筛选对应的编码基因。从细胞中提取mRNA,建立含有大量cDNA的集合体，并将它们连接、克隆到特殊的载体中，这个cDNA克隆的集合体就称为cDNA文库。16直到20世纪80年代，研究人类医学遗传学的科学家只能通过仔细分析患者疾病的病理生理学期望发现易感基因。血红蛋白基因突变引起血红蛋白病是第一个在分子医学遗传学水平定性的人类疾病。血红蛋白病特别便于研究，因为疾病的病理学可以定位于红细胞，相应的血红蛋白可以通过收集外周血得到。绝大部分分子病、遗传性代谢缺陷（酶）病如白化病、苯丙酮尿症和黑尿病等，都是采取的这一策略。不幸的是，这种方法仅能用于有限的、可以直接测定生化缺陷的人类致病基因。172、定位克隆到20世纪80年代后期，现代分子医学遗传学强有力的手段，使仅通过图谱位置定位人类疾病易感基因成为可能，而不必借助任何功能信息。这种方法称为定位克隆。疾病－染色体定位－基因序列－mRNA－蛋白质/生物学功能18又称为“逆向遗传学”，始于20世纪80年代后期利用遗传连锁或细胞遗传学定位技术将致病基因定位于染色体的特定区带。定位：通过连锁分析找出与目的基因紧密连锁的遗传标记在染色体上的位置。克隆：从定位的染色体区段内分离克隆所要的基因，并进一步研究其功能。19疾病遗传标记，染色体定位基因序列mRNAcDNA蛋白质产物生物学功能功能

疾病

基因2、定位克隆20定位克隆有两个主要瓶颈，第一是应用细胞遗传学或连锁分析方法将基因定位于特定的染色体区域，第二是从该区域内所有可能候选基因中找出正确的基因。定位克隆鉴定的第一批基因利用了特定基因座的染色体畸变。杜氏（Duchenne）肌营养不良（DMD）基因的克隆是一个重要的例子。21DMD是X连锁隐性遗传病。经过大量的细胞遗传学研究发现，DMD患者中大量存在Xp21区域的易位和缺失，因此推断DMD基因最有可能定位于Xp21。两个研究小组分别用两种不同的方法克隆了DMD基因。DMD患者每个病例受累的常染色体不同，但在X染色体上的断裂点总是p21区域。

22一组分析了一例DMDX常染色体易位，该易位将X染色体序列与21号染色体短臂区域连在一起。21号染色体短臂区域含有核糖体基因，即编码核糖体RNA的重复序列。因为那些序列是已知的，所以克隆X染色体的DNA断裂点已成为可能。正如期望的一样，这段X染色体序列位于DMD基因内。另一研究组分析了有Xp21.2微小缺失的男孩的DNA，该男孩无任何遗传缺陷家族史，却被发现同时患有DMD、慢性肉芽肿（CGD，为一种白细胞缺陷，严重影响抗感染能力）和其他两种X连锁性状。这四种X连锁疾病的同时发生引起仔细的细胞遗传学研究，最终发现了Xp21.2的微小缺失。23研究人员先对正常的、母亲的基因组DNA进行MboI酶切，使基因组DNA变成短的、带有GATC粘性末端的小片段；再将这些小片段变性解链后与200倍以上、缺失片段的患者DNA片段进行杂交。患者的DNA经过超声波随机打断，故其末端缺乏特异的GATC粘性末端。由于患者的Xp21.2有缺失，在杂交时就没有相应的片段与来自正常母亲的该区域的DNA片段杂交形成双链，因此该区域的DNA片段只来自母亲，所以在复性时就只能自身结合，这样其两端仍具有GATC粘性末端。24而其他区域的DNA片段由于患者DNA片段是过量的，几乎所有来自正常个体的粘性末端片段都会与患者中相应的片段杂交形成杂合双链，即一端有粘性末端，另一端没有。再对这些杂交后的双链与一个用BamHI酶切后的载体（具有相同的GATC粘性末端）进行克隆。结果就只能克隆到两端皆为粘性末端的片段，即只来自正常个体而患者不具有的片段。25亨廷顿（Huntington）舞蹈症是一种常染色体显性遗传病，尽管过去进行了多年的研究，通过比较亨廷顿患者与正常人的组织，仍未发现任何特殊的蛋白质异常。因此，没有任何构成亨廷顿病基础的遗传缺陷线索可进行功能克隆。同时，在任何患者均未发现特定区域的染色体异常。26亨廷顿病是第一个通过系统筛查多态性遗传标记，进行连锁分析而定位的遗传病，这种方法通常称为基因组扫描。由于亨廷顿病是常染色体显性遗传，外显率高，并容易获得大家系的特点而成为首选研究目标。因此，研究人员开始大量收集家系资料和开发一系列DNA多态标记探针，希望在发现某种连锁前试用100-300个探针。幸运的是，试用的第12个探针，称为G8与亨廷顿病基因座（HD）紧密连锁。G8标记位于4号染色体短臂顶端，说明HD位点也一定接近该位置。27尽管G8和HD间的连锁关系在1983年首先报道，完成定位克隆过程到鉴定亨廷顿病致病基因和亨廷顿病遗传缺陷的特征描述，又花费了十年。亨廷顿病是由HD蛋白氨基末端三核苷酸CAG动态重复引起。CAG重复范围在正常的染色体为10-30拷贝，在HD染色体为36-121拷贝。CAG重复的长度与症状出现的年龄一般相关（重复的长度越长，预示出现症状越早）。现在十年又过去了，HD蛋白的功能尚不清楚。HD基因的克隆为最终认清HD的病理生理学和开发新的治疗方案提供了强有力的研究新手段。28

A-1型短指（趾）症：法拉比（Farabee）1903年在他的哈佛大学医学院博士毕业论文中首先报道了，即世界上第一例孟德尔常染色体显性遗传病，以后作为遗传学的经典例子被全世界的生物学和遗传学教材广泛引用。

贺林实验室利用布依族、苗族和汉族的三个A-1型短指（趾）症大家系，对该病的致病基因进行了精确定位（位点定在2q35-36区）、克隆，并首次发现了人IHH基因和该基因上的三个突变位点是导致A-1型短指（趾）症的直接原因。29301、遗传病诊断

（五）疾病诊断、防治用医学遗传学手段可从细胞遗传学、DNA水平诊断遗传病。脆性X染色体综合症：脆性X染色体综合症是常见的遗传疾病之一，发病率在男性约为1/1250，在女性约为1/2000，没有明显的人种特异性。其主要临床表现为不同程度的智力低下。从临床症状很难区分脆性X染色体综合症与其它遗传性智力低下，如Down氏综合症的区别。细胞遗传学诊断是鉴别该病的指标之一。31患者的外周血淋巴细胞在体外培养，如培养基缺乏叶酸或胸腺嘧啶，约10%—40%的患者，其X染色体的带Xq27.3不被染色，如同染色体发生了断裂。与脆性X染色体综合症有关的基因已被克隆，并被命名为FMR1。脆性X染色体综合症为三连体重复疾病之一。该基因第一外显子5‘非翻译区有一个三核苷酸重复序列（CGG）n,CGG重复序列的长短在人群中具有多态性，正常人为6—50个CGG重复序列。脆性X染色体综合症患者含有230—1000个重复序列，称完全突变。CGG重复序列在约50—230之间为前突变状态。32用PCR和DNA印迹法可以诊断正常、前突变和完全突变个体。携带前突变的女性不表现症状，但在传递给子代时重复序列进一步延长，达到完全突变的长度，其子代出现症状。但是，携带前突变的男性将重复序列传给子代时，不出现进一步延长。当母亲减数分裂时，从前突变扩展到全突变的风险与重复次数成比例。当重复次数小于70时，风险低于20%；当重复次数大于90时，风险大于99%。33200年悬案一朝了断美国第三任总统托马斯.杰弗逊。据传，1802年杰弗逊在丧偶后与黑人女管家海敏斯有染，且有一私生子伊斯通。1998年，美国一个著名的分子遗传学实验室检查了有关人员Y染色体上的序列，了断了这桩公案。杰弗逊两个堂兄弟的5名男性后裔Y染色体，海敏斯与其丈夫所生大儿子5名男性后裔Y染色体，伊斯通男性后裔Y染色体DNA序列比对。伊斯通男性后裔Y染色体DNA序列与杰弗逊家系相同，不同于海敏斯与其丈夫所生大儿子家系。342、产前诊断

产前诊断的目的是当未来父母生育受累子女的风险极高时，给他们提供一种无受累子女的安全保障，在一定程度上降低某种特定疾病的风险概率。产前诊断运用损伤性（羊膜穿刺术、绒毛采样、经皮采血）和非损伤性方法（超声诊断技术）。351）、羊膜穿刺术羊膜穿刺术即从羊水中抽取少量液体（通常为20ml），其中含有从皮肤、消化道、呼吸道及泌尿生殖道内壁上皮脱落的胎儿细胞。羊水中的细胞可离心收集直接分析或进行培养后再分析。羊膜穿刺术通常在妊娠16周进行。36羊膜穿刺术适应症：（1）高龄妇女，通常限定为35岁以上的妊娠妇女，这个年龄Down氏综合症及其它染色体三体型的风险显著增加。（2）染色体异常家族史、以前出生的孩子有染色体三体型的既往史或已知的平衡易位携带者。（3）孟德尔式遗传疾病。37（4）产前三联筛查异常：在母体血清中同时检测甲胎蛋白、绒毛膜促性腺激素和雌三醇时，在35岁以下的妇女中可检出50%-60%Down氏综合症出生婴儿。由于对35岁以下的妇女一般不作常规的产前诊断，而现在75%Down氏综合症出生婴儿发生在这一年龄组妇女身上，因此对于Down氏综合症来说，产前三联筛查是一种重要的遗传筛查试验。产前三联筛查异常者(甲胎蛋白、雌三醇异常降低，绒毛膜促性腺激素异常增高)，需做羊膜穿刺术确诊。382）绒毛采样（CVS）这种技术利用一个精细而有弹性的聚乙烯导管在超声探测仪监视下有子宫颈进入子宫腔，吸取少量胎儿绒毛组织，胎儿的绒毛组织必须仔细地与母体组织分离开，并且可以用多种方法检测。绒毛采样通常在怀孕9-12周时进行，时间比羊膜穿刺术早，但操作失败及胎儿流产的风险略有增加。393）经皮采血（PUBS）胎儿的血液可在妊娠大约18周时采到，在超声波探测仪监视下将针插入脐带中抽取，称经皮采血，用于快速核型鉴定。