基因诊断(2010级研究生)

基因诊断

genediagnosis

心血管病研究所、生命科学研究中心唐朝克博士、教授、博导1自1976年采用分子杂交技术首次完成了对α地中海贫血的基因诊断以来，基因诊断的方法学研究取得了很大进展，先后建立了限制性内切酶酶譜分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分析、聚合酶链反应（PCR），以及近年发展起来的DNA芯片等方法。2主要内容1基因诊断的原理和主要技术2基因诊断在遗传病诊断中的应用

3基因诊断在法医学中的应用

4基因诊断在感染性疾病中的应用5基因诊断在肿瘤学中的应用

3第一节基因诊断的原理和主要技术

一、基因诊断的定义

二、基因诊断的优点三、基因诊断的主要技术4一、基因诊断的定义

基因诊断是通过直接探查基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。基因诊断的探测目的物是DNA或RNA。前者反映基因的存在状态，而后者反映了基因的表达状态。探查的基因又分为内源基因（即机体自身的基因）和外源基因（如病毒、细菌等）两种。前者用于诊断基因有无病变，而后者用于诊断有无病原体感染。5二、基因诊断的优点

传统的诊断方法是先发现疾病的表型，再把基因产物即蛋白质或其抗体氨基酸序列弄清楚，运用分子生物学技术分离到该基因，并通过測序确定突变部位。6基因诊断又称逆向遗传学，先找出基因变异，再分析基因产物，最终探明生理作用的临床机制。因此基因诊断往往在疾病出现之前就可以完成，在诊断时间上存在显著的优越性，有利于及时治疗。

7基因诊断检查的是基因DNA，人体所有细胞的基因变化是一致的。因此，只要抽血检测血细胞，或检测羊水中的脱落细胞，就可以进行基因诊断。而不需要对某一特定的组织或器官进行检测。因此，亦不受空间限制，使用十分方便。

8基因诊断特点1高特异性:碱基配对原则.2高灵敏性:高灵敏标记的探针及PCR扩增3应用广泛性:遗传病和产前诊断;法医学;

感染性疾病;肿瘤.9二、基因诊断的主要技术

核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)聚合酶链反应(PCR)单链构象多态性检测(SSCP)限制性片段长度多态性(RFLP)分析法DNA序列测定DNA芯片技术。10(一）单链构象多态性检测

单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。DNA经变性形成单链后，在中性条件下单链DNA会因其分子内碱基之间的相互作用，形成一定的立体构象。11相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。长度相同而构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现出不同的迁移率。SSCP常与PCR联合应用，称为PCR-SSCP技术。121314

珠蛋白15(二)限制性片段长度多态性(RFLP)分析法在人群中,个体间基因组的核苷酸序列存在着差异性,称为DNA的多态性。突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失可使DNA序列发生改变。其中有些可能造成限制酶酶切位点的增加、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶酶切位点数目、位置发生改变。16用限制酶切割基因组时，所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度就不同，这就是限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。能导致限制性片段发生改变的酶切位点又称为多态性位点。17限制酶酶切图谱分析法基因突变可能导致基因上某一限制酶识别位点的丢失或其相对位置发生改变，以此酶消化待测DNA和野生型DNA，通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。18RestrictionendonucleaseenzymesrecognizespecificpalandromicsequencesofdeoxyribonucleotidebasesandspliteachDNAstrandataspecificsitewithinthatsequence.Thisone,calledEcoR1,recognizesthebasesequence"G-A-AT-T-C"andcutseachstrandbetweenthe"G"andthe"A"asshownbytheredarrow.192021第二节、基因诊断在遗传病诊断中的应用

基因诊断是在分子遗传学的基础上发展起来的，最早用于遗传病的诊断，而且现在已经知道许多遗传病的致病基因及其突变类型。因此基因诊断在遗传病中所取得的成绩最为突出。现以地中海贫血发生的分子缺陷为例,作一简单介绍.

221)基因缺失：由于α珠蛋白基因缺失所致的α地贫迄今已发现20多种，由于缺乏的基因及其部位的不同，导致不同珠蛋白链合成的异常和不同类型的地中海贫血。2)终止密码突变：由于终止密码突变生成肽链延长的异常血红蛋白。

233)单个碱基替代：珠蛋白基因中某些碱基发生替代可能会影响珠蛋白链的合成速率，导致地中海贫血。大致区分为两类：①生成极不稳定的异常血红蛋白：结果异常链迅速降解，珠蛋白链的净合成实际上等于0，如β112胱氨酸（UGU）-精氨酸（CGU）；α125亮氨酸（CTG）-脯氨酸（CCG）。24②珠蛋白mRNA前体加工缺陷：在靠近内含子的编码区若发生碱基替代，往往改变了mRNA前体分子被剪接酶识别的部位，导致mRNA前体加工为mRNA的过程迟缓，甚至加工无效，产生地中海贫血,如β26谷氨酸（GAG）-赖氨酸（AAG）。254)移码突变(frameshiftmutation)：由于碱基的插入或缺失，造成编码区阅读框的移位，形成不成熟的终止密码子。5)无义突变(nonsensemutation)：指正常的密码子变为终止密码子，肽链合成提前终止。6)错义突变(missensemutation):指基因编码序列中碱基的置换导致了某一密码子的改变,从而使其编码另一种胺基酸。262728293031导致α地贫的分子基础主要为α珠蛋白基因缺失，而β地中海贫血则主要由β珠蛋白基因的点突变所致。迄今，世界上已发现了120种不同的地中海贫血类型，而导致中国人β地中海贫血的突变有15种。大多数α地中海贫血是由于α珠蛋白基因缺失所致，而最终都导致α珠蛋白mRNA含量的减少。因此，对α地中海贫血的基因诊断有两类：

32一类是检测其DNA:方法:1放射性核素标记α珠蛋白DNA探针,2从羊水细胞提取的DNA进行液体分子杂交，3DNA限制性内切酶酶谱分析法，4PCR法检测α珠蛋白基因有无缺失；另一类则是检测其mRNA含量:方法:用RT-PCR法33第三节基因诊断在法医学中的应用

一、DNA指纹在法医学中的应用(一)原理法庭科学中DNA的检测目的有两个，即个人识别和亲子鉴定。在法庭科学中应用DNA分析技术最早的报道是在1985年。34英国遗传学家Jeffreys发现同一个体不同来源组织的DNA,在Southern印迹图上的DNA谱带完全一致