majun-基因工程-外源基因的表达

第十章外源基因的表达生物科学与技术学院原核表达系统正确表达的基本条件常用的大肠杆菌表达载体的元件外援蛋白质表达部位提高外源基因表达效率的方法表达产物的检测大肠杆菌表达外源基因的优势和劣势优势：全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物劣势：缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素正确表达的基本条件外源基因不能带有间隔序列（内含子），不能用基因组DNA，要用cDNA或者合成的人工DNA。必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达。外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放式阅读框架。通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。表达载体的组成启动子转录终止子翻译起始序列翻译增强子启动子启动子(promoter)是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。原核生物的启动子是由两段彼此分开且高度保守的核苷酸序列组成。■-35区（TTGACA）：位于转录起始位点上游的-35bp附近，是RNA聚合酶初始识别和结合位点。■-10区（Pribnow框，TATAAT）：RNA聚合酶结合于此处导致DNA双链形成单链。原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有lac（乳糖启动子）、trp（色氨酸启动子）、PL及PR（λ噬菌体左向和右向启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGTPlLTTGACAGATACTPrecATTGATATATAATLac表达系统以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。转录调控机理具有多顺反子结构，基因排列次序为：阻遏基因（lacI）-启动子（lacP）-操纵基因（lacO）-结构基因（lacZ-lacY-lacA）正调节因子CAP（活化蛋白）负调节因子

lac

I（阻遏蛋白）lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效转录cAMPCAPlacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录RNA聚合酶基因工程中使用的lac启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5

cAMP葡萄糖代谢cAMP浓度降低cAMPCAPCAPlacUV5突变体PlacUV5突变体能够在没有CAP（活化蛋白）

存在的情形下非常有效的起始转录，受它控制的基因在转录水平上只受lacI的调控，因此用它构建的表达载体在使用时比野生型Plac更易操作。负调节因子lacI在无诱导物情形下，lacI基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacARNA聚合酶基底水平转录lacI

Plac

lacO

lacZlacYlacA高效转录RNA聚合酶IPTGmRNATac表达系统tac启动子是由trp的–35序列和lacUV5的–10序列拼接而成的杂合启动子。调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于trp和lacUV5启动子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。lac、tac

启动子对宿主菌的要求在普通大肠杆菌中，LacI

阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上lac

操纵子转录调控的需要。当多拷贝的

lacO

随着带有lacUV5、tac

启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI

阻遏蛋白与lacO

的比例显著下降，无法保证每一个lacO

都能获得足够的LacI

阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱导物存在的情形下，lacUV5、tac

启动子有较高的本底转录。为了使以Lac、Tac

表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的LacI

阻遏蛋白的lacI

基因的突变体lacIq

被应用于表达系统。大肠杆菌JM109等菌株的基因型均为lacIq

，常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。需在表达载体中插入lacIq

基因以保证有较多的LacI

阻遏蛋白产生。Trp表达系统以大肠杆菌trp操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。转录调控机理色氨酸启动子Ptrp

受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp

介导的目的基因表达。

Ptrp

OtrpRNA聚合酶基底水平转录高效转录mRNA

Ptrp

Otrp去除色氨酸高效转录mRNA

Ptrp

Otrp加入IAARNA聚合酶RNA聚合酶T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。转录调控的机理T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。化学诱导型温度诱导型双质粒系统T7RNA

聚合酶T7启动子目的基因

T7RNA聚合酶基因化学诱导型噬菌体DE3是

l噬菌体的衍生株，一段含有lacI、lacUV5

启动子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其

int基因中用噬菌体DE3的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统。

T7RNA聚合酶基因

lac

启动子E.Coli（DE3）T7启动子目的基因T7RNA

聚合酶IPTG诱导温度诱导型PL

启动子控制T7RNA聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7噬菌体启动子的转录。这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。

T7RNA聚合酶基因PL

启动子E.Coli（CE6）T7启动子目的基因T7RNA

聚合酶热诱导cI857双质粒系统一个质粒带有T7RNA聚合酶基因，另一个质粒带有T7启动子和目的基因两个质粒的复制子和抗性标记不能相同调控方式为控制T7RNA聚合酶的启动子调控类型T7RNA

聚合酶热诱导T7启动子目的基因

T7RNA聚合酶基因

PL

启动子

ci857

p15Aori

KanRColE1oriAmpRci857

阻遏蛋白

PL

启动子T7RNA聚合酶T7启动子目的基因PL

和PR

表达系统以l噬菌体早期转录启动子PL和PR

为核心构建的表达系统，在野生型l噬菌体中，PL和PR

启动子转录与否决定了l

噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。转录调控的机理：由

l噬菌体PE

启动子控制的cI基因的产物是PL和PR启动子转录的阻遏物。cI基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于宿主与噬菌体之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI基因产物的产生和消失是相当困难的。因此PL和PR

表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)的基因产物来调控PL和PR

启动子的转录。在较低温度（30℃）时以活性形式存在在较高温度（42℃）时失活脱落宿主菌中没有cI基因产物，PL、PR启动子的高强度直接转录，带有PL或

PR启动子的表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定。转录终止子外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。强终止子的选择与使用目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2

以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。翻译起始序列外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）。核糖体结合位点大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：位于翻译起始密码子上游的6–8个核苷酸序列5’UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子。SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成基因编码区5’端若干密码子的碱基序列。SD序列的影响一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD（UAAGGAGG）序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG

四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低。

SD序列与起始密码子之间的序列的影响SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍SD序列与起始密码子之间的距离的影响SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。起始密码子及其后续若干密码子的影响大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。生物体对密码子的偏爱性不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含量在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体φX174）基因组中，密码子第三位上的U和A出现的频率较高；在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多细胞内tRNA

的含量基因突变基因突变是指由于DNA碱基对的置换、增添或缺乏而引起的基因结构的变化，从而引起表型的改变。基因突变的特征随机性：突变可发生在生物个体的任何时期和生物体的任何细胞多向性：同一基因座上的基因可独立发生多次不同的突变而形成复等位基因可逆性：突变的方向可逆,可以是正突变，也可以是回复突变有害性：突变会导致许多疾病的发生稀有性：在自然状态下发生突变的频率很低

可重复性：对于任何一个基因位点，基因可以一定频率反复发生点突变(pointmutation)

点突变：DNA链中一个或一对碱基发生的改变。两种形式：碱基置换和移码突变碱基置换（basesubstitution）：DNA链中一种碱基对被另一种碱基对所替代，从而使三联体密码意义发生改变而引起的突变。碱基置换分为：转换和颠换AGTC转换（嘌呤和嘌呤之间、嘧啶和嘧啶之间替换）颠换（嘌呤和嘧啶之间的替换）碱基置换可引起如下几种生物学效应：

1、同义突变

2、错义突变

3、无义突变

4、终止密码突变同义突变（samesensemutation）：碱基被替换之后，产生了新的密码子，但新旧密码子同义，所编码的氨基酸种类不变，因此同义突变并不产生突变效应。错义突变（missensemutation）：碱基替换使编码某种氨基酸的密码子变成编码另一种氨基酸的密码子，从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。错义突变引发疾病——镰刀状红细胞贫血无义突变（non-sensemutation）：碱基替换使编码氨基酸的密码变成终止密码UAA、UAG或UGA。终止密码突变（terminatorcodonmutation）:DNA分子中的某一个终止密码突变为编码氨基酸的密码，从而使多肽链的合成至此仍继续下去，直至下一个终止密码为止，形成超长的异常多肽链。移码突变（frame-shiftmutation）：基因组DNA链中插入或缺失1个或几个碱基对，从而使自插入或缺失的那一点以下的三联体密码的组合发生改变，进而使其编码的氨基酸种类和序列发生变化。碱基对插入和（或）缺失的数目和方式不同，对其后的密码组合的改变的影响程度不同。移码突变引起的最小变化是在DNA链上增加或减少一个遗传密码导致合成的多肽链多或少一个氨基酸，若大范围改变密码组合则会引起的整条多肽链的氨基酸种类及序列的变化。移码突变的后果严重，通常是导致一条或几条多肽链丧失活性或根本不能合成，进而严重影响细胞或机体的正常生命活动。

外源基因在大肠杆菌中的表达目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种：表现为不溶性的包涵体颗粒：包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。存在部位：细胞质、细胞周质。表现为可溶性的蛋白质：可溶性的蛋白通常也叫融合蛋白，是将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。融合蛋白可随宿主菌的蛋白表达进入细胞质或者跟随宿主菌的蛋白分泌到胞外。包涵体的组成蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物：占大部分，具有正确的氨基酸序列，但空间构相错误，因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物：如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。：包括DNA、RNA和脂多糖等。大肠杆菌基因工程菌的蛋白表达策略包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体形成的本质是细胞内蛋白质的不断聚集。主要