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文档简介

第七章抗原抗体反应及应用抗原抗体的特异性反应可以在体内进行,也可以在体外进行。这是血清学技术方法的依据。抗体反应技术的广泛应用已远远超出了免疫学、医学、甚至生命科学的范围,成为一种微量、灵敏、快速的检测分析方法。本章介绍的内容有:抗体的制备抗原与抗体反应原理免疫分析方法第一节抗体的制备抗血清:用抗原人工免疫实验动物,可以获得含有抗体的血清,称为抗血清(antiserum)。多克隆抗体(polyclonalantibody):多个抗原决定簇→不同B细胞→克隆→多种抗体。一、抗血清的制备免疫动物抗原:病毒、细菌、蛋白质或半抗原。佐剂及乳化:佐剂是使抗原在注射部位缓慢释放,增加免疫效果。免疫动物:豚鼠、家兔、小鼠、大鼠、羊和马。两次注射,初次免疫和再次免疫,间隔3-4周(大动物),10-14d(小动物)。2.抗血清的纯化采血:心脏或动脉抗血清的纯化:目的:去除血清中其它蛋白质的干扰纯化方法:硫酸铵盐析法抗体在30%-50%饱和度白蛋白70%-80%饱和度

25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升。层析法——分子筛层析法,离子交换层析法,亲和层析法保存:低温保存,4℃或-20℃;冷冻干燥保存。抗血清的特性鉴定检测参数:效价、亲和力和交叉反应检测方法:免疫沉淀、ELISA和放射免疫

①效价(滴度):在给定的条件下,结合一定量抗原的抗血清的稀释度(最大稀释倍数)。抗血清经一系列稀释后与一定量的抗原反应,以能检测抗血清最大稀释倍数即为该抗血清的效价。

效价是一个抗体相对含量的半定量指标。亲和力:表示抗血清与相应抗原的结合强度。抗原抗体反应:Ag+AbAgAbK+K-K=[AgAb][Ag][Ab]K=K+K-K+为结合速度常数K-为解离速度常数K为亲合常数二、单克隆抗体(MAb)的制备1.制备原理单克隆抗体:单一种B细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白分子。是B细胞克隆的标志,是一种独特型抗体,是针对一个抗原决定簇的。用B细胞克隆技术来制备。杂交瘤技术:1975年G.Köhler(科勒)和Milstein(米尔斯坦)创立的。获得1984年的诺贝尔医学与生理学奖。米尔斯坦(C.Milstein)1927~英国和阿根廷双重国籍

科勒(G.Kohler)1946~1995

德国人

杂交瘤技术基本原理:B细胞与肿瘤细胞进行杂交。B细胞——分泌抗体,但不能在体外长期培养。肿瘤细胞——能在体外长期培养,可在低温保存。杂交瘤细胞——能分泌单克隆抗体,可长期传代培养,又可在液氮中保存。2.细胞来源及选择原理B细胞——Balb/c小鼠脾脏。肿瘤细胞——诱变得到Balb/c小鼠骨髓瘤细胞(次黄嘌呤和胸腺嘧啶缺陷型)。〖名称〗:BALB/c小鼠1913年,贝格(Bagg)从美国商人欧希尔(Ohio)处购得的白化小鼠原种,以群内方法繁殖。麦克·多威尔(MacDowell)在1923年开始作近交系培育,至1932年达26代,命名为BALB/c品系。安德尔文特(Andervont)等人使BALB/c广为传播和应用。1985年我国从美国国立卫生研究院(NIH)

引进到中国医学科学院实验动物研究所,为BALB/c第180代。

毛色:白化。

主要用途:广泛地应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学研究,以及单克隆抗体的制备等。③缺陷型骨髓瘤细胞的特点:是次黄嘌呤鸟嘌呤核酸转移酶和胸腺嘧啶激酶的缺陷型在培养基中加入次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)后,能生长。在培养基中加入次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T),再加入氨基喋呤(A)后,不能生长。④杂交瘤细胞的特点:带有B细胞的全套基因。在培养基中加入次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T),再加入氨基喋呤(A)后,能生长。用HAT培养基筛选。因为只有脾细胞和骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中生长。5-磷酸核糖焦磷酸尿嘧啶RNADNA次黄嘌呤(H)胸腺嘧啶(T)氨基喋呤(A)次黄嘌呤鸟嘌呤核酸转移酶胸腺嘧啶激酶3.细胞杂交与选择培养(1)融合:只有脾细胞和骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中生长。(2)阳性杂交瘤细胞的筛选抗体活性检测方法:常用ELISA和凝集试验。(3)单克隆化克隆化:使许多细胞克隆混合生长的细胞分离为单个的细胞克隆的过程。单克隆化方法:有限稀释法,一般稀释至0.8个细胞/孔荧光激活细胞分拣法。4.扩大生产生产方法3种:腹水制备:相同动物品系→腹腔注射→收集腹水→纯化。大瓶培养:摇瓶培养中空纤维反应器:半透膜的成束的微孔纤维。1234制备过程:1.融合2.筛选3.克隆化4.扩大生产5.应用(1)医学诊断试剂

广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。①病原微生物抗原、抗体的检测;

②肿瘤抗原的检测;

③免疫细胞及其亚群的检测;

④激素测定;

⑤细胞因子的测定。(2)蛋白质的提纯

单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质(如Speharose2B、4B、6B等)上,并制备成层析柱。当样品流经层析柱时,待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合,其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后,改变洗脱液的离子强度或pH,欲分离的抗原与抗体解离,收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。(3)肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术

将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接,利用单克隆抗体的导向作用,将药物或放疗物质携带至靶器官,直接杀伤靶细胞,称为肿瘤导向治疗。另外,将放射性标记物与单克隆抗体连接,注入患者体内可进行放射免疫显像,协助肿瘤的诊断。三、基因工程抗体的制备抗体的化学修饰抗体Fc段+双功能连接剂+荧光素(同位素、酶、发光化合物、稀土元素、药物、毒素等)药物、毒素等→药物的定向载体=“生物导弹”意义:诊断试剂;药物的定向载体2.抗体基因文库定义:将不同的重链和轻链基因随机组合,克隆到合适的表达载体中,在原核细胞表达不同的抗体,从这个抗体库中,用抗原可以筛选到相应的抗体基因。抗体基因来源:杂交瘤细胞或动物B细胞的DNA和mRNA。载体:线装噬菌体宿主:大肠杆菌抗体的噬菌体文库:抗体以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面。抗原筛选抗体——单克隆抗体优点:可获得人源抗体,快速方便获得单克隆抗体3.抗体基因的改造定义:将鼠抗体的V区基因和人源抗体的C区基因重组,获得的嵌合抗体,可保留鼠抗体对抗原的亲和力,又减弱鼠源抗体对人的免疫原性,提高治疗性抗体的效果。表达细胞:骨髓瘤细胞或中国地鼠卵细胞。第二节抗原抗体反应原理一、抗原抗体作用的热力学与动力学溶液中抗原抗体的化学平衡抗原与抗体的结合是可逆的,以非共价键相连:范德华力、静电引力、氢键和疏水键。结合与解离的强度取决于抗原与抗体的亲和力。抗原与抗体结合的化学平衡如果以S代表抗体结合位,以L代表抗原决定簇,以SL代表抗原与抗体的复合物,则抗原与抗体在溶液中的反应如下:复合物浓度[SL],抗体结合位的浓度[S],抗原决定簇浓度[L],K+和K-分别为结合和解离反应速度常数,Ka是平衡常数。K+K-K-K+Ag+AbAgAb即S+LSL[SL][S][L]K-K+Ka==浓度平衡点[SL][S]或[L]抗原抗体结合反应示意图时间二、抗体与多价抗原结合的浓度带现象多价抗原:一个大分子抗原有多个抗原决定簇而成为多价抗原。单价抗原:一个抗原决定簇的抗原。抗体与单价抗原形成的复合物是可溶性的抗体与多价抗原形成的复合物大多数能形成沉淀。沉淀反应可用于研究抗体与大分子抗原结合的特性。沉淀反应曲线测定方法:在一定量的抗体中,逐渐增加抗原浓度,沉淀的形成与抗体的比例密切相关。曲线分3个区:抗体过量区(前带现象):小分子复合物,不形成沉淀,。抗原抗体等带区:大量沉淀,无游离的抗原或抗体。抗原过量区(后代现象):沉淀少。抗体过量(无沉淀)抗原抗体适量(有沉淀)抗原过量(无沉淀)沉淀的抗体量抗原量抗原抗体反应与沉淀形成第三节常见免疫分析方法免疫分析方法定义:是利用抗原与抗体特异性反应的特性对抗原或抗体进行量或质的测定分析。特点:特异、灵敏和快速。例如:单克隆抗体检测法可测出蛋白质的一个氨基酸的差异;放射免疫法测定的量达到μg甚至ng的水平;免疫沉淀法:反应时间在几小时,几分钟或更短的时间。应用领域:医学、生命科学的几乎各个领域,甚至食品科学、环境科学、分析化学等。一、免疫沉淀溶液中的环状沉淀试验在体外可溶性抗原与相应抗体形成肉眼看见的沉淀物。在液相中形成的沉淀不容易观察判断,利用抗原和抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于观察。对照1:101:201:401:801:160抗血清稀释度抗原沉淀线抗血清环状沉淀实验示意图2.凝胶扩散沉淀

抗原抗体在半透明的半固相介质中进行沉淀实验。抗原分子与抗体分子在凝胶介质中自由扩散,相遇形成沉淀。以琼脂扩散实验较为常用。单向免疫扩散:抗体混于琼脂中,小孔中加入抗原,抗原向周围均匀扩散,与抗体形成沉淀环。可用于定量测定免疫球蛋白和补体的含量等。双向免疫扩散:抗原和抗体向周围扩散后可在两孔之间形成白色沉淀线,可用于抗原或抗体的定性检测。缺点:时间长,灵敏度低。沉淀线形状的变化显示抗原间是否存在共同的抗原决定簇。3.免疫电泳火箭电泳:单向免疫扩散与电泳结合的一种方法。在电场作用下抗原向正极扩散,与抗体形成沉淀峰(火箭型沉淀线)。需时短,能检测微量抗原。对流电泳:在电场作用下抗原与抗体相对扩散,形成沉淀线。对流电泳较双扩快速和灵敏。二、免疫标记免疫标记技术:将已知抗体或抗原标记上易显示的物质(示踪物),通过检测标记物反映有无抗原抗体反应,从而间接测出微量的抗原或抗体。目前有四种方法:放射免疫分析法:以同位素为示踪物,为最灵敏、可靠的免疫标记技术。酶联免疫吸附试验(ELISA)免疫荧光技术亲和标记的免疫分析标记免疫技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点:高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术1.放射免疫分析法标记同位素:125I,131I、3H和35S检测方法:液相体系用液体闪烁仪计数;固相体系用X射线胶片显影。直接法与竞争法检测检测竞争法基本原理

采用定量的标记抗原(Ag+)和非标记抗原(Ag)竞争性结合有限量特异性抗体(Ab)的反应。放射活性放射活性抗原浓度抗原浓度放射性同位素标记分析法示意图直接法竟争法放射性同位素标记分析法示意图2.酶联免疫吸附试验(ELISA)

(enzymelinkedimmunosorbentassay)(1)定义:抗原与抗体吸附在固相表面,如聚苯乙烯微量板,抗原与抗体反应后,将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体,而结合的抗原或抗体上被标记的酶仍保持活性,催化底物形成有色产物。(2)测试方法:可目测或用分光光度计比色进行定性或定量检测。(3)测试过程使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性(固相抗原/抗体的形成)

在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应(抗原抗体反应)用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。(酶标抗原抗体复合物的分离)

加入底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。(显色反应)酶来源底物检测波长/nm碱性磷酸酶牛小肠黏膜对硝基酚磷酸盐405过氧化物酶辣根邻苯二胺/过氧化氢492β-半乳糖酶大肠杆菌对硝基酚β-半乳糖405常用标记的酶及其底物(4)ELISA技术类型

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体,在这种测定方法中有3种必要的试剂:固相的抗原或抗体,酶标记的抗原或抗体,酶作用的底物。①双抗体夹心法(直接夹心法)特点:非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇

②间接法③捕获法(反向间接法)主要用于血清中某种抗体亚型成分(如IgM)的测定。④直接法

用酶标

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