冠脉结核法大鼠心梗模型制作存活率的方法

冠脉结核法大鼠心梗模型制作存活率的方法

21世纪以来，心血管领域的新技术不断出现，如环腺炎（pci）、冠状动脉内生殖器（ptca）、冠状动脉外生殖器（ptca）、冠状动脉内生殖器（ptca）、冠状动脉外生殖器（ptka）、冠状动脉旁路移植、心脏移植等。然而，这些技术的应用没有显著降低心血管疾病的死亡率。新的治疗方法——心肌干细胞移植技术早在19世纪末就有人提出,但心肌再生医学并未长足发展,依然停留在基础研究阶段。标准化的动物模型是心肌再生医学研究的基础。当前,心梗模型的制作方法很多,如冠脉结扎,冠脉冷凝、电灼烧,冠脉夹闭等,但受到同行认可的且贴近心肌梗死形成生理状态的方法主要是冠脉结扎法。常规冠脉结扎法存活率较低,影响实验的进行,本实验通过精细化、改良及简化步骤,提高了存活率,现报告如下。1材料和方法1.1实验材料1.1.1实验动物健康SD雄性大鼠60只,体重(230±20)g,由北京农业大学动物中心提供。1.1.2实验药物及设备盐酸氯胺酮注射液(福建古田药业)、速眠新Ⅱ注射液(军需大学兽医研究所)、盐酸肾上腺素注射液(北京永康药业)、盐酸利多卡因注射液(天津金耀有限公司)、盐酸多巴胺(广州明兴制药)、阿托品注射液(天津金耀有限公司)、江湾Ⅰ型微型人工呼吸机(第二军医大学实验仪器厂)、气管插管针(小动物胃管,前端有钝头,可以防止气道损伤及漏气)。1.2实验方法1.2.1+氯胺酮应用本实验通过实验比较最终选择效果稳定,对体温、呼吸、心肺功能影响较小的速眠新+氯胺酮应用方案,增加了术中的平稳性。盐酸氯胺酮20mg/kg、速眠新Ⅱ0.2mg/kg进行腹腔注射。注射前回抽,确定无回血。插管前给予阿托品0.1ml腹腔注射,可有效防止气道分泌物,防止拔管后分泌物过多造成鼠窒息死亡。1.2.2顺气道+舌根将鼠置于大小适中的固定板上,四肢用活结固定。本实验改进了插管所用导管,选用小动物洗胃的金属管(见图1),前端为钝头,可以减少对气道的损伤。将鼠四肢固定于硬板,置于头高脚低位,用强光灯照射鼠的颈部,一手将鼠的舌向后外牵拉(最好不要用镊子钳夹,容易局部用力过大,造成鼠舌头损伤),顺气道看去,可见喉部组织及舌根;另一手用插管针轻轻向上挑舌根,这时即可看见不断开合的声门,轻轻将管对准声门向前探去,但不要接触到声门周围组织,待声门开放的时候,匀速将管送向声门,此时因视野受阻,插管手常会遇到阻力,说明声门关闭,但管又顺利插入,说明管进入食道。根据解剖位置确定气道与食道交叉点,解剖鼠气管、声门(图2,见第942页),当气管插管遇到阻力时,可将管向后退0.5-1cm,向后上送入,遇到阻力时可稍微用力(注意:不能向下送),则99%插管成功(该细节也是本实验成功率提高的关键之一)。用一根细丝在管口试验,看是否有气体流出,以判断是否在气管中,如果不是,可将插管退出,进行二次插管,如果3次都没有插管成功,就应放弃此鼠。插管成功后,用胶布将插管针固定在鼠上颌和头部,将舌头偏向一侧。1.2.3呼吸频率及通气量呼吸机设置为容量控制模式,潮气量为10-15ml/250g体重,呼吸频率为50-60次/min,吸呼比为1∶1,通气量为潮气量+1ml,氧气提供以大气为主,不需额外给氧,这也是本实验简化的重要步骤之一。1.2.4挂大肌和挂大骨肉线大鼠取仰卧位,去毛:范围为胸骨左侧,上限为胸骨上缘与腋中线连线,下限为胸骨下缘与腋中线连线。铺无菌手术单,碘伏消毒手术区,连接呼吸机。用食指触心尖搏动区,一般位于第3-4肋间,以最强的点为中心,作一横行切口,切口前端靠近胸骨,末端最远可达腋前线,长度约1-1.5cm,依次切开皮肤、深浅筋膜,注意避开腋前线皮下血管,防止出血;眼科剪剪开胸大肌和前锯肌,显露肋骨;由第3-4肋间钝性分离肋间肌,分离肋间肌的范围不可过广,不能超过皮肤切口的范围。在第3、4肋骨挂一根缝合线,折双折,用于牵引暴露手术视野(术后可用此线直接缝合);牵开胸骨可见粉红色肺随呼吸机频率收缩,用小纱布或棉签头沾生理盐水后将肺压向左侧胸腔,可见心脏外一层淡白色心包膜,用弯镊轻轻撕开后可见心耳、心脏表面静脉(常误认为是冠脉)、肺动脉圆锥;注射器给予心脏表面浸润利多卡因两滴,使心率减慢;从左心耳下方2-3mm入针,缝扎的中点在左心耳和肺动脉圆锥的交界和心尖连线上,缝扎的方向应和房室交界线垂直,以5-0或6-0的无损伤缝合线进行缝扎,进针深度约1.5-2.0mm,结扎时力度要适中,既能在打结的过程中见到结扎血管下方大面积心肌表面变得苍白,室壁运动明显紊乱或减弱,但又不能力度过大,以防止将心肌离断。结扎后行心电图检查,看是否与术前有明显变化,并观察心脏跳动情况,约5min左右,如果出现心律失常,可以在心脏表面滴或腹腔注射少量的利多卡因,若不能转复则直接心脏按摩,多数心律失常能够恢复;若出现心率减慢,当心率过低时,可给予肾上腺素心室直接注射,大部分可以恢复心率。1.2.5大鼠肌肉活检胸腔内置入头皮针的塑料吸管,一端接10ml注射器;用4号线将第3-4肋缝合,然后逐层缝合肌肉,最后注射器抽吸,使胸腔内变为负压,然后收紧缝线、打结关闭胸腔。用0号线在肋间切口的一端缝合打结,连续缝缝合皮肤。在大鼠腹腔内注入40万U青霉素以预防感染。呼吸机维持3-5min,再行心电图检查,待鼠生命体征平稳,即可拔出气管插管。1.2.6全鼠舌后坠鼠在手术后应置于单独小笼中,上方用台灯照射以保温。此时很多鼠容易出现舌后坠的问题,可将一棉签横置于鼠口中,同时将鼠舌拉出,以畅通呼吸道,必要时还可经口吸痰。应保温至少12h。饲养槽的垫料1周更换2次。1.3心梗模型的识别1.3.1一般形态观察术后4周,麻醉处死大鼠,洗净心腔内的积血,观察心脏的外形变化,在梗死瘢痕的中线切开心脏,与同月龄、同体重的鼠心脏进行比较。1.3.2肌肉注射复合麻醉术后4周,按大鼠体重用盐酸氯胺酮15mg/kg、速眠新Ⅱ0.15ml/kg肌肉注射复合麻醉。在四肢及前胸皮下插入针电极,电极位置参照人体相应部位,描记Ⅰ、aVL、V1、V3、V5导联心电图,动态观测术前、术后ECG变化。两个或两个以上相邻导联Q波形成且>1/4R波,宽度>0.04s为心肌梗死。1.3.3标本沉底、定底TTC染色后的心室组织用4%多聚甲醛溶液固定12-24h,入30%蔗糖液直至标本沉底。恒冷切片机连续横切片,片厚8μm,HE染色后光学显微镜下观察。2术后大鼠的死亡情况本实验使用SD大鼠60只,大鼠开胸后,前降支结扎,即刻行心电图检查,可见心率较快,约250次/min,ST段上移(见图3),提示心梗模型形成。心肌梗死模型制作的成功率100%,术后1d大鼠死亡1只,考虑死于心衰;术后3d死亡1只,动物总存活率达96.7%。预实验过程中,动物多于术中死亡,少数于术后1-3d死亡。死亡原因绝大多数为心律失常,只有很少的鼠死于失血过多或心衰,术后伤口及肺部感染的极少见。术后4周心脏,可见心脏左心室明显扩大且形态不规则,说明心室发生了重构;缺血区的室壁变薄局部凹陷,颜色较周围的心肌浅,心腔内可见心内膜纤维化,心室壁变薄。HE染色显示缺血区心肌大部分被纤维组织所取代(图4,见第942页)。3讨论3.1梗死模型动物的选择和制作通常动物模型选择的原则是:经济实用,具有可操作性;模型稳定,尽量与人结构相近;具有可靠的动物源,不触犯国家相关法律。国内用以建立标准心肌梗死模型的动物选择很多,比较常见的就是大鼠、兔和小型猪。相对于其他动物,大鼠有许多便利:①大鼠的品系比较纯正,动物组内差异较少;②大鼠经济实惠,容易饲养,术前、术后管理比较容易;③大鼠的冠脉系统侧支循环比较少,一旦结扎之后,容易出现一个比较固定的缺血区,这样使心肌梗死的模型容易稳定;④大鼠心肌梗死模型的制作手术比较小,单人就能操作,对实验仪器要求不高,便于实验的开展。所以一般基础研究选用大鼠作为模型动物。3.2两种模型的对比心肌梗死的产生方式有很多种,冠状动脉前降支结扎法、药物注射法、冷冻法、栓塞法、电凝法等,冠脉结扎法只是其中的一种。此外,有报道用小鼠敲除基因已达到造成心肌梗死的效果。通过冷凝、电灼烧等物理方法造成的心肌梗死,与正常生理状态形成AMI距离过大,其参考意义有限。冠状动脉阻塞术和冠状动脉夹闭术也能达到心肌梗死的目的,而且冠脉阻塞术不需要开胸,冠脉夹闭术能精确调整狭窄的程度,但此两种方法也有其致命缺点。冠脉阻塞术需要在血管造影术的基础上来完成,冠脉夹闭术需要在大动物如犬身上进行,而且引起梗死的时间和范围变化较大,不具有可控制性和实验结果的可预见性。这两种模型有着各自的缺点,而最终效果又和冠脉结扎法相似。因此,冠脉结扎法制作心肌梗死模型是目前各种心肌梗死模型中最有价值、最易于推广的心肌梗死模型制作方法,但因操作的失误及术后管理等问题,其死亡率仍较高,给试验带来了较大的不稳定性及结果的偏倚。传统开胸结扎手术,因大鼠心率较快(200-300次/min),结扎准确性较低,多次结扎增加了胸腔开放时间。本实验也选用冠脉结扎法制作心梗模型,开胸后通过利多卡因心脏表面麻醉减慢心率,提高了结扎准确性,减少了胸腔开放时间;明显提高了术中及术后的存活率,提高了动物模型的稳定性。3.3肌肉注射麻醉选择冠脉结扎法行心梗模型制作,开胸手术,麻醉是不可避免的。有些文献报道,不需要麻醉及呼吸机支持,在2-3min之内完成冠脉结扎并关胸,同样可以保障模型制作成功,当然成功率及存活率较低。本实验将静脉麻醉、肌肉注射麻醉及腹腔注射麻醉进行对比发现:肌肉注射操作简单,可单人完成,且麻醉效果及安全性高于静脉麻醉和腹腔麻醉。所以肌肉注射麻醉成为心梗模型制作最常用的麻醉方式。本实验将氯胺酮、速眠新、利多卡因分别进行肌肉注射麻醉,且联合应用速眠新与氯胺酮(1∶1),比较麻醉效果,麻醉时间分别为:氯胺酮20-30min;速眠新25-30min;利多卡因麻醉效果较差,无法使小鼠在术中保持平稳;速眠新+氯胺酮45-50min,麻醉过程比较平稳,对心肺功能影响较小,对呼吸抑制作用较小,诱导速度比较快,约1-2min起效。有些文献报道戊巴比妥钠麻醉效果较好,麻醉稳定,但其作用剂量与中毒剂量相近,且使实验动物体温下降,术中、术后常需要保暖,明显增加了术后模型的死亡率。本实验通过比较最终选择效果稳定,对体温、呼吸、心肺功能影响较小的速眠新+氯胺酮应用方案,增加了术中的平稳性,也是本实验模型存活率提高的原因之一。3.4气管切口缝合不当机械通气需要建立通畅的气道,一般有两种即经口插管和气管切开。其中,经口气管插管最符合生理状态,创伤小,术后对鼠的呼吸功能影响最小。气管切开插管虽然直观、准确,但容易出现气道出血和分泌物过多,导致窒息;术后气管切口缝合不当还容易造成气管狭窄或气管瘘,术后肺感染的可能性也大,这些都对术后鼠的存活率造成很大的影响。经口气管插管要求可视下将管送入气管,从理论上讲比较困难,但实际操作中技巧性要求比较高,一次插管不成功或者手法力量过大,可造成喉头黏膜水肿,导致窒息。根据相关文献报道,只要看到声门,就可直接插入气道,但在实际操作中并非如此。气管插管技巧如上方法中所述。本实验过程中发现,有些大鼠在插管过程中呼吸抑制,随之心率下降,给予呼吸机维持、肾上腺素等治疗无效。查阅相关文献未见报道,可能与大鼠个体差异有关,某些大鼠对咽喉部刺激比较敏感,反射性出现呼吸抑制,也可能是中枢性呼吸抑制。3.5后一种方法当前,冠脉结扎路径主要有两种:一种是剪断肋骨,压迫胸腔和腹腔将心脏从胸腔内挤出,结扎后再将心脏放回;另一种是通过侧开胸,不切断肋骨,用乳突牵开器撑开肋骨,通过在鼠身体下方垫的纱布使心脏暴露充分然后结扎。前一种因心脏和大血管受到牵拉,容易引起急性心律失常,剪断的肋骨容易造成肺损伤,增加术后鼠的死亡率;后一种方法虽然避免了前面的缺点,且能控制结扎位置和深度保持一致,从而使心梗模型缺血范围相对固定,但步骤繁琐,实际操作起来会影响手术速度,且心脏处于不断跳动状态,无法做到绝对固定。本实验与传统实验操作相比,大鼠取平卧位,取第3-4肋间开胸,无需挤压或是牵开器,而用两根缝合线固定牵开,心脏暴露术野开阔,表面利多卡因浸润,减少了心脏跳动的次数,进针准确,提高了冠脉结扎的准确性,减少了手术操作时间及开胸暴露的时间,减少了大鼠术中致死因素,因此提高了手术的成功率及存活率。3.6进一步护理技术本实验预实验过程中发现大鼠术中死亡率较高,其余绝大多