常用血管性痴呆动物模型研究进展

常用血管性痴呆动物模型研究进展

血管性脑瘫（vd）是由脑血管疾病（缺血或出血或慢性缺氧缺血性脑病引起的一过性疾病。这是临床上常见的老年性脑瘫。这种疾病在年龄组中的发病率最高，其次是门静脉疾病。血管性痴呆的神经病理分类包括缺血性和出血性脑损害所致的痴呆以及低血氧-低灌流性痴呆。患者多为慢性、进行性、持续性智能障碍综合征,临床表现为记忆及认知等功能障碍综合征。VD动物模型种类繁多,其主要的研究思路就是建立一种与人类血管性痴呆发病及病理特点相似的血管性痴呆动物模型。近年来关于VD动物模型的研究日渐增多,并取得了一定进展,对VD的临床及实验研究起了很大的推动作用。本文就近年来常用的VD动物模型综述如下。1单因素流型1.1血管梗死的诊断1.2动物模型的建立郑敏等分别采取改良的2-VO造模方法(间隔3d分2次结扎双侧颈总动脉)和传统的2-VO方法建立VD模型,结果显示,两组大鼠学习记忆能力无显著性差异(P>0.05),但改良模型组动物存活率为80.0%,明显高于传统模型组(45.0%),具有显著性差异(P<0.01),认为改良2-VO法是建造大鼠VD模型的理想方法。黄新武等采取间隔3d分2次结扎双侧颈总动脉建立VD模型,模型组术后死亡2只,其余全部存活,存活率96.0%,一般情况良好。术后4w和8w,与对照组比较,模型组大鼠逃避潜伏期均明显延长,在120s内穿越平台的次数明显减少(P<0.05)。但模型组在4w和8w之间比较差异无统计学意义。试验结果也表明间断永久性结扎双侧颈总动脉法是建造大鼠VD模型的理想方法。黄文革等采取改良造模方法(间隔7d分2次结扎双侧颈总动脉)和传统的2-VO方法建立VD模型,结果术后7d,改良模型组动物存活率(86.7%)明显高于传统模型组(40.0%),两组有显著性差异(P<0.05)。术后8w与12w,与假手术组比较,两种方法模型组逃避潜伏期均明显延长(P<0.05),但两造模组之间无显著性差异,故认为2-VO改良造模法能降低大鼠VD模型动物死亡率,是制作VD模型的理想方法。马明等将大鼠分为假手术组、同时双侧颈总动脉结扎模型组(同时结扎组)及分次结扎模型组,分次结扎模型组再分为1w及2w间隔组,结果1w和2w间隔组大鼠死亡率较同时结扎组明显降低(P<0.05),且存活状态较好;同时结扎组、1w及2w间隔组大鼠搜寻平台游泳时间均较假手术组有显著性差异(P<0.05),但三者之间无显著性差异。结论显示,分次结扎颈总动脉建立大鼠VD模型手术死亡率低、可重复性强、效果稳定,而间隔时间设定为1w或2w,两者的动物死亡率及造模效果无显著性差异。以上实验结果表明,改良血管阻断法较传统2-VO法动物存活率显著提高,同时模型动物存在明显的学习记忆障碍,是较成熟的VD模型制作方法。1.3实验结果与分析即从大鼠一侧颈内动脉注入纤维蛋白、血凝块、中心球及血栓诱导剂阻断大脑中动脉血流,如此实现大脑中动脉缺血再灌注(供血)VD造模。李林等采用改良的大脑中动脉栓塞法(middlecerebralarteryocclusion,MCAO),建立VD样学习记忆障碍的大鼠模型。实验动物随机分成3组:VD模型组、假造模实验对照组和正常对照组,正常对照组逃避潜伏期为15.22±2.34s,假造模实验对照组逃避潜伏期为16.17±2.81s,VD模型组逃避潜伏期为28.75±5.27s,结果VD模型大鼠发生了空间学习记忆功能障碍,与两对照组比较有显著性差异(P<0.01)。李林等应用MCAO法,结果模型大鼠均发生了学习、记忆功能障碍;VD大鼠定位航行试验的逃避潜伏期明显延长,空间探索试验的逃避潜伏期延长更明显,而逃避频率减少次数,与对照组比较有显著性差异(P<0.01),表明制备的痴呆动物模型具有较好仿真人类AD和VD的特点。李志勇等采用线栓法和2-VO法分别制备大脑中动脉梗死(MCAO)和慢性脑低灌注型(CCA)VD模型,结果MCAO模型和CCA模型大鼠逃避潜伏期和游泳路径延长(P<0.05或P<0.01),CCA模型大鼠空间记忆能力下降明显,而MCAO模型记忆保持能力较差。实验结果表明,MCAO法无须开颅,大脑中动脉缺血再灌注效果确切,但对大鼠的体重和操作技巧要求严格。缺点是对毗邻脑组织可能产生损伤,有潜在的脑脊液瘘形成。1.4比较大鼠学习记忆与空间探索能力此法又称光化学诱导法,即大鼠麻醉后固定在立体定位仪上,从尾静脉上注射玫瑰红(RB,20mg/kg),然后切开局部头皮暴露颅骨,用光导纤维引导冷光定向照射裸露的颅骨20min,照射部位即产生局部梗死灶。蔡晶等利用光化学反应诱导血栓形成的原理进行实验,结果模型组大鼠学习记忆与空间探索能力下降,与对照组和生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。该研究电镜下发现,模型大鼠出现细胞凋亡早期征象,表明光化学法建立的VD模型具有VD部分临床病理特征,较其他动物模型更有优越性。沈欣等对大鼠急性脑损伤光化学诱导脑血栓形成,结果大鼠脑梗死面积、血管损伤面积、血小板聚集均显著增高。该方法梗死部位明确,操作简单,手术创伤面小,重复性好,功能障碍明显,动物存活时间长,而且病理改变和超微结构变化与人类VD相似,是一种成熟的可推广应用的动物模型。但由于微血管损害和血脑屏障开放早,与人类常见的缺血性脑卒中存在差异。1.5去皮质血管模型赵小贞等选用经Y型电迷宫筛选记忆良好的24月龄SD大鼠通过颅外安置小磁铁吸附经大鼠尾静脉注射的四氧化三铁方法建立痴呆模型,结果大鼠出现明显的记忆能力下降,在光学显微镜下见到痴呆大鼠大脑皮质和海马区微血管梗死灶,海马锥体细胞核深染、固缩、变形,实验认为,颅外安置小磁铁吸附经大鼠尾静脉注射的四氧化三铁方法具有操作简便、创伤少、重复性好、较快导致痴呆的优点,该方法缺点是仅模拟了单一部位的缺血梗死,而且铁粉停留在肺、肝中,影响生活质量及干扰指标测定结果。此外,司楚银等首次报道采用去大脑皮层法制作VD模型。实验取30只Wistar雄性大鼠,4~5个月龄,250~300g,随机分为2组:假手术组及去除大鼠脑左侧皮层血管建立模型组。去大脑皮层法为:动物麻醉后暴露颅骨,用牙科钻钻孔并翻开颅骨,剪开硬脑膜,暴露软脑膜,在解剖显微镜下用沾生理盐水的棉签轻轻擦拭,至软脑膜下见不到血管为止。本研究对去大鼠脑皮层血管模型进行了行为学、AchE组化、ChAT、BDNF、trkB免疫组化研究,与假手术组对比,其差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。本模型优点是充分模拟了血管性痴呆的病理改变,适于做长期的血管性痴呆的皮质以及皮质下结构的病理观察,同时本模型造成皮质缺血的部位、大小恒定,特别是顶叶的扣带皮质损害相当恒定。但缺点在于打开硬脑膜时损及脑脊液,同时可能损及硬脑膜窦,致动物死亡。2大鼠血管性痴呆型的制备宋莉莉等采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导慢性实验性糖尿病(DM)大鼠模型,永久性结扎双侧颈总动脉制作VD模型,结果VD组和DM+VD组在术后2周即出现学习记忆能力下降,并呈逐渐下降趋势;DM+VD组较同期的VD组下降更为严重。结论表明STZ诱导的糖尿病大鼠经颈动脉结扎后成功建立了VD模型。蔺心敬等采用反复大鼠双侧颈总动脉缺血再灌注加剪尾放血法制备血管性痴呆大鼠模型,行为学检测结果表明,模型组大鼠跳台实验结果与假手术组及对照组大鼠的检测结果间均存在显著性差异(P<0.05),血管性痴呆大鼠有明显的学习、记忆障碍,且该组大鼠海马组织Ach含量持续降低,神经元明显减少、缺血坏死明显。结论认为本方法可制备理想的血管性痴呆动物模型,用于基础研究及药物筛选或疗效评价。窦金金等采用改良2-血管阻断法(2-VO)+硝普钠降压法制作VD大鼠模型,结果2-VO+硝普钠降压法制作VD模型动物存活率高,与对照组比较大鼠水迷宫定位航行实验及空间探索实验结果相比存在差异(P<0.01),海马神经元损伤明显,行为学异常。结论表明改良2-VO+硝普钠降压法是制作大鼠血管性痴呆模型的理想方法之一。马大勇等采用雄性成年Wistar大鼠40只,体重200~250g,随机分为4组:对照组、再灌注组、再灌注后结扎组、降压并结扎组,模型制作分别采用3种2-VO多因素方法。结果3种模型组间术后48h死亡率无明显差异(P>0.05),术后20d时,3种模型组的学习记忆能力均明显下降,到术后30d再灌注后结扎、降压并结扎2组与对照组始终差异明显(P<0.01),但2组之间差异不明显(P>0.05),说明两者的Morris水迷宫学习成绩较为稳定。在海马CA1区锥体细胞病理损伤方面,以再灌注后结扎组最为严重,降压并结扎组次之,再灌注组则较轻。说明再灌注损伤大鼠VD模型不够稳定,而再灌注后结扎、降压并结扎两VD模型较稳定。万睿等采用脂肪乳灌胃合并脑缺血再灌注制作VD模型,结果定位航行测试、空间搜索测试结果及大鼠AchE、SOD活性和MDA含量变化与正常组及单纯脑缺血再灌注模型组相比,均有显著性差异(P<0.05)。结果表明,脂肪乳灌胃合并脑缺血再灌注模型组较单纯脑缺血再灌注血管性痴呆动物模型可造成更加明显的学习记忆障碍,且脑组织中AchE及MDA的含量明显增高,实验认为该模型可作为今后中医药研究血管性痴呆的理想模型。以上多因素VD模型的制备,是从模拟人类VD发病的某个侧面来完成的,与临床实际情况还有一定的偏离,尚需不断完善。3致病性高血压大鼠1963年,Okamoto和Aoki培育了自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypertensiverat,SHR),其中有一重要亚系为自发性高血压脑卒中倾向大鼠(Stroke-Prone,SHR)。SHR大鼠在出生后前几个月时间内能够自行发展成为稳定的高血压,同时伴随出现高血压相关的包括脑组织在内的多种靶器官损伤。高血压引发的脑血管病变和海马神经元的损伤是高血压发展为血管性痴呆的病理基础。自发性高血压大鼠(SHR)的海马退行性改变和星形胶质细胞的反应类似于认知功能障碍的神经元变形的症状。由此表明,SHR大鼠可以作为血管性痴呆的动物模型。但此大鼠价格较昂贵,来源有限,不宜开展大规模的研究。4血管阻断法综上所述,近年对VD动物模型的研究取得了长足的进步,但目前尚无用于血管性痴呆基础研究的标准动物模型。VD是一种多因素疾病,其发生发展是多种致病因素、多个病理环节相互作用和累积的结果,建立理想的VD动物模型对于探明VD的发病机制、病理学特点,预防与治疗VD均有着重要意义。然而建立一种理想的VD动物模型存在一定困难,现VD模型存在的问题主要有:手术难度大,动物难长期存活;梗塞范围难控制;开颅本身可能对脑缺血的病理有影响;模型制作结果与临床实际还有一定的偏差等。随着科学技术的发展及对VD动物模型研究力度的深入,相信VD动物模型的制作将会取得更大的突破。缺血性脑血管病是VD最主要的致病因素。根据阻断颈部动脉的数目,目前常用的血管阻断法有2-血管阻断法(2-VO),4-血管阻断法(4-VO)。实验动物多使用大鼠,因为大鼠较其它动物价格便宜,来源充足,其脑血管解剖和生理接近人类,便于进行动物智能及电生理检查,容易为大家接受。2-血管阻断法(2-VO),即大鼠双侧颈总动脉永久性结扎。赵宪林等采用Wistar雄性大鼠,实验组按2-VO方法结扎双侧颈总动脉,结果显示实验组与正常对照组定位航行实验和空间探索实验均有非常显著性差异(P<0.01),表明2-VO制作VD模型成功。吴剑芸等将84只Wistar雌性老龄大鼠随机分为两组:假手术组和模型组,模型组用丝线结扎双侧颈总动脉,缝合切口,成功制作VD模型,但模型组大鼠在24h内的死亡率(46%)较高。由此可见,2-VO操作相对简单,但造成大鼠死亡率较高,不利于长期观察。4-血管阻断法(4-VO),即电凝大鼠双侧椎动脉,造成永久性闭塞,24h后用微动脉夹反复夹闭双侧颈总动脉,每次5min,间隔1h,共3次。姚国恩等使用老龄Wistar大鼠先进行7d穿梭箱训练,选AAR≥80%的健康大鼠60只随机分为对照组和VD模型组,采用Pulsinelli.s4-血管阻断(4-VO)制作动物模型,实验结果显示,造模2周后模型大鼠在穿梭箱检测实验中AAR较对照组显著下降(P<0.05),4周和2个月时更加明显(P<0.01),海马脑片长时程增强的诱导出现明显障碍,故认为4-VO是制作VD模型较理想的方法。王萍等