牙颈部流水线与牙周致病菌引起牙周炎的比较研究

牙颈部流水线与牙周致病菌引起牙周炎的比较研究

高糖饮食和紧密连接动物牙齿颈部是一种相对成熟、广泛使用的方法。移植牙周阻力也是一种常见的方法。单独使用其中的某一种方法,存在着建立牙周炎动物模型所需实验时间长、可控性差的缺点,而多个诱导因素的联用可较快地诱导牙周炎的形成。本研究的目的在于对高糖饲料加牙颈部丝线结扎与高糖饲料加牙颈部丝线结扎加接种牙周致病菌建立大鼠牙周炎模型的方法进行比较,观察几种方法在同一种动物引起牙周炎的病程是否相同,及寻找各种方法建立大鼠牙周炎模型的最佳时期。1.细菌培养和微生物测量1.1实验动物及分组选用40只牙体牙列完整,无龋坏及牙周病的5周龄SD大鼠(四川大学华西校区实验动物中心提供)。将40只大鼠随机分为对照组(N组)和P1、P2及P3三个实验组,每组10只大鼠。1.2实验方法对N组大鼠不采取任何干预措施,常规喂饲鼠食和饮水。P1、P2、P3组大鼠均在肌肉注射200mg/kg的盐酸氯胺酮麻醉后,用丝线结扎双侧上颌第二磨牙牙颈部,结扎线尽量放入龈沟内,遇结扎线脱落重新结扎。结扎后给予10%的糖水代替饮水。P2、P3组大鼠,在丝线结扎上颌第二磨牙牙颈部后,按每只大鼠每天20mg的剂量,将氨苄青霉素磨碎后放入饮水中口服,共3d,以便抑制不利于牙龈卟啉菌定居生长的内源性细菌。喂饲氨苄青霉素3d后,通过管饲给予每只大鼠0.5ml1.5×109CFU/ml的牙龈卟啉单胞菌[Porphyromanusgingivalis(P.g),ATCC33277,由华西口腔微生物医学工程重点实验室提供]48h培养物(P2组)或0.5ml1.5×109CFU/ml的P.gATCC3327748h培养物+0.5ml1.5×109CFU/ml的具核梭杆菌[Fusobacteriumnucleatum(F.n),ATCC25586,由华西口腔微生物医学工程重点实验室提供]48h培养物(P3组)。以后每48h追加一次,共管饲细菌3次。以上动物在实验前和喂饲细菌后第2、4周时对实验牙进行微生物学检查。1.3微生物学检查分别在实验前和喂饲细菌的第2、4周时每组随机选取5只大鼠,去除结扎的丝线,用灭菌镊子将灭菌纸尖插入牙周袋底,采集左上颌第二磨牙龈下菌斑,放置约10s后取出,将纸尖插入有1mlTD转送液的厌氧转送管管底送检;将转送管置于漩涡震荡器上,震荡1min,使菌斑团块分散;取0.01ml样本接种于牛心脑浸液-辅助琼脂(BHI-S琼脂)培养基,用三角推棒涂布均匀。厌氧培养48h。对初代培养物进行菌落计数、菌落和菌细胞形态的观察。选取不同的单个菌落接种于牛心脑浸液(BHI)琼脂培养基上行耐氧实验和细菌的次代培养。对纯化的可疑的产生黑色素的G-杆菌和梭杆菌次代培养物行生化鉴定(反应板微量快速生化试验),根据伯杰氏细菌学鉴定手册确定是否为P.g和F.n。计算出P.g和F.n的检出量,作为微生物学检测指标。菌量测定采用一定浓度下龈下菌丛细菌菌落的形成单位(colonyformingunit,CFU)计数,单位为CFU/ml,并将其转化为对数。1.4牙槽骨吸收量的测定水平性骨吸收的测量采用改良Crawford法。在实验前和喂饲细菌的第2、4周,微生物学检查完成后,每组各处死大鼠5只,取下左侧上颌骨,置于10%的福尔马林中固定,漂洗并去除软组织,保留硬组织,观察牙槽骨吸收的情况。用体视显微镜测量每个磨牙的釉牙骨质界到牙槽嵴顶的距离,每牙测量6个位点:颊、舌侧的近、中、远6点。每牙的各位点测量值之和为该牙的总牙槽骨吸收值。1.5光镜观察在各观察时间点,用盐酸氯胺酮深度麻醉大鼠后,处死,取下整个上颌骨,组织修整后将组织块放入10%福尔马林中固定48h,放入15%EDTA溶液中,4℃脱钙7d,逐级酒精脱水,常规石蜡包埋,沿牙长轴颊舌向纵切(切片厚度5μm)。常规HE染色,光镜下观察。1.6统计学方法将所得数据建立数据库,采用方差分析进行数据分析,P<0.05为有统计学差异。2实验牙的材料和组织学检查2.1微生物学检查结果微生物学检查显示:接种细菌前,各组均未培养出P.g或F.n;2周时,N组和P1组也未培养出P.g或F.n;而P2组P.g的检出量为6.20±0.57lgCFU/ml,且与N组相比有统计学意义(P<0.05),未检出F.n;P3组P.g的检出量为6.20±0.57lgCFU/ml,F.n的检出量为4.36±0.62lgCFU/ml,与N组相比均有统计学意义(P<0.05)。第4周时,P1组检出有少量F.n,P2和P3组的细菌检出情况与2周时相比较牙周致病菌检出量有所减少。2.2牙槽骨吸收情况肉眼观察:各实验组在第二周时就开始出现不同程度的牙槽骨吸收,4周时进一步加重,其中以高糖饲料+丝线结扎动物牙颈部+混合菌组为最重,部分实验牙已可看到暴露的牙根;值得一提的是,接种细菌的两组,除实验牙(上颌第二磨牙)外,邻牙远离结扎线一侧的牙槽骨吸收也很明显:如图1所示,这可能是由于本实验采用管饲法接种细菌,邻牙虽未用丝线结扎牙颈部,但可能有牙周致病菌的定植。各组实验牙的总的牙槽骨吸收值见附表。2.3组织学检查2.3.1对照组(N)光镜观察显示,对照组和各实验组在基线时大鼠牙周组织的情况基本相同:牙龈上皮结构完整,上皮下结缔组织内见少量的炎细胞浸润,结合上皮附着于釉牙骨质界附近的牙表面,位置正常,为角化的复层鳞状上皮;牙周膜纤维整齐排列;牙槽嵴顶尖锐,固有牙槽骨形态结构完整。实验2周和4周时,N组光镜下观察牙周组织情况与基线时相比无明显变化。2.3.2高糖饲料+丝线结扎组(P1)2周时牙龈上皮糜烂,上皮钉突增生,结合上皮向根方增殖,但无明显的牙周袋形成;结合上皮周围有大量的中性粒细胞浸润,伴有少量的淋巴细胞和巨噬细胞;水平组纤维开始出现胶原疏松、水肿、变性,纤维排列紊乱,牙周膜间隙增宽,有炎细胞浸润;牙槽骨可见较多吸收陷窝,部分动物有牙槽嵴高度降低。见图2。4周时结合上皮根向增生,牙周袋形成,牙周袋袋底可见浅溃疡;增生的上皮网眼中炎细胞以浆细胞、淋巴细胞为主;胶原纤维破坏至主纤维的部位,有牙周袋形成,袋内较多炎性渗出物;牙槽骨吸收明显,破骨细胞活跃。见图3。2.3.3高糖饲料+丝线结扎+P.g组(P2)2周时结合上皮处有溃疡形成,上皮与牙面分离,上皮根向增殖不明显,上皮病变以破坏为主,袋内上皮糜烂,袋内可见细菌团块;上皮下炎细胞浸润明显,仍以中性粒细胞为主;牙周纤维破坏明显;牙槽骨吸收明显,有小的死骨形成;成骨活动不明显。见图4。4周时有明显的牙周袋形成,结合上皮根增殖明显,上皮层次增多,增生的上皮网眼内,仍有较多炎细胞浸润,但量较2周时减少,以淋巴、浆细胞为主;牙槽骨吸收已超过根中份。2.3.4高糖饲料+丝线结扎+混合菌组(P3)2周时牙周袋形成,袋内上皮及龈乳头表面糜烂及溃疡形成,结合上皮糜烂坏死,上皮增殖不明显;袋内可见大块的细菌团块;牙槽骨吸收破坏较重,有大块死骨形成;可见较多牙骨质吸收陷窝,陷窝内可见破牙骨质细胞,尤以根尖1/3为重。根分叉处大量炎细胞浸润,胶原水肿、变性明显。见图5。4周时牙周袋进一步加深,上皮增生明显,袋内壁的病变主要在结合上皮处,炎细胞浸润也有所减少;牙槽骨吸收已近根尖;根尖处牙骨质破坏明显。3实验大鼠牙周炎模型建立方法的确定早在1964年Keyes等就利用高糖低蛋白饲料(Keyes2000)成功地诱导了地鼠典型的牙周炎的形成,其后不少学者利用改良的Keyes2000在狗及大鼠等动物身上也都成功地造成了牙周炎。丝线结扎动物牙颈部造成菌斑滞留也是一种较为常用的建立牙周炎模型的方法,周秀青等采用丝线结扎大鼠牙颈部以诱导牙周炎的形成。而接种牙周可疑致病菌也是一种较为常用的建立牙周炎动物模型的方法,Ichie等的研究表明单一致病菌虽然也能引起实验性牙周炎,但多种致病菌协同作用可加重病情进展和疾病的严重性。上述各种方法均能诱导牙周炎的形成,但存在实验时间较长的缺点,而将以上方法中的一种或两种联合起来作用于动物,能更早地获得牙周炎模型。本研究就高糖饲料加牙颈部丝线结扎与高糖饲料加牙颈部丝线结扎加接种牙周致病菌建立大鼠牙周炎模型的方法进行比较,结果发现:高糖饲料加牙颈部丝线结扎组(P1组)在第2周时的病变主要以牙龈的急性炎症为主,尚未形成明显的牙周炎;4周时牙龈的病理改变为慢性炎症过程,有牙周袋形成及牙槽骨的吸收,表明采用此法建立牙周炎的动物模型,4周是观察牙周炎病变较适宜的时期。而P2组在2周时,牙龈亦表现为一个急性炎症反应,牙龈上皮可见较重的糜烂甚至溃疡形成,牙槽骨破坏明显,较多动物可见死骨形成,是一个较典型的急性重度牙周炎活动期的病理表现;而4周时,牙龈根向增生明显,有深的牙周袋形成,袋内壁上皮层次明显增多,上皮完整性有了一定程度的恢复,溃疡和糜烂已不多见,炎细胞也以淋巴、浆细胞等慢性炎症细胞