微核的形成与遗传毒性

微核的形成与遗传毒性

微核（mcn）是真核生物细胞的异常结构，也是间期细胞形态的特征。一般认为,微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断产生的。在细胞有丝分裂时,受到有害理化因子的损伤,染色体发生断裂,在下一次分裂后期,丧失着丝粒的染色体片断行动滞后,不能进入子细胞的主核,形成滞留在核外的微小染色质块,即微核。有些研究者认为,微核可以是细胞凋亡的产物,当致畸因素导致凋亡基因激活,内切酶激活,切割DNA,形成细胞核碎片,最终导致产生许多微核。微核的形成是细胞受遗传毒物作用后的一种遗传学终点,以观察细胞中微核的形成来检测遗传毒物,称为微核试验。微核试验是以动植物为材料,利用细胞生物学方法观察其出现的微核率(micronucleusfrequency,MNF)来表示材料受遗传损伤程度的一种检测遗传毒物的方法。微核试验创建于20世纪80年代,目前许多国家和国际组织已将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理安全性评价的必做试验。近年来,随着分子生物学技术的迅速发展,大大拓展了微核试验的检测和应用范围,已发展成为能同时检测染色体断裂、丢失、分裂延迟、不分离、DNA损伤修复障碍、HPRT基因突变、凋亡、细胞分裂不平衡等多种遗传终点,因而近年来国际上有人提出了新微核试验的概念,从而使微核试验焕发出新的生机。1影响微核生成的因素1.1ca2+依赖内切酶基因表达是造成细胞凋亡的一个重要因素在正常情况下,生物也会自然出现较低频率的微核,在人类中一般会随年龄的增大而增加,往往女性高于男性。主要是和自身的免疫力低下以及超氧化物、自由基、易氧化物等因素较多有关。微核也是细胞凋亡的产物,当程序性死亡基因激活,随之Ca2+依赖性内切酶激活,切割DNA,形成细胞核碎片,形态学表现为核深染,染色质边缘分布的帽形核,最后导致微核形成。一些研究表明,caspase-3除了在细胞凋亡途径中作为效应因子外,也与微核的形成有关。此外,有研究表明,细胞内P53的含量对于苯诱导的微核形成有影响。1.2对hlt-6细胞微核试验和基因型的检测化学诱变剂可分为染色体断裂剂和非整倍体剂。这类物质较多,如苯三酚(1,2,4-苯三酚,BT)在氧化成酮时产生活性氧损伤DNA和其他一些细胞大分子,BT能使淋巴细胞微核率上升2倍,使Hlt-6细胞微核率上升8倍,且总微核数在两类细胞中呈剂量相关性。BT不仅引起染色体数目和结构的变化,而且可通过产生活性氧而间接引发点突变。纺锤丝毒性药物如秋水仙碱、HO-221等能直接抑制动物细胞纺锤丝的形成,阻止细胞分裂后期纺锤丝将染色体拉至细胞的两端从而形成微核。Ando等应用抗肿瘤药(HO-221)抑制小鼠细胞纺锤丝微管组装,破坏纺锤体,结果诱导出多倍体和亚二倍体细胞以及较大的微核。1.2.1胞的二极、正常核细胞核的主要成分是染色体,在正常的情况下细胞分裂时染色体被纺锤丝牵引平均分向细胞的二极,形成二个正常的核。在染色体断裂剂存在的情况下,染色体发生断裂,并不发生重接或不在原处重接,则形成了无着丝粒的断片,在细胞分裂后期不能向两极移动,而残留在细胞中央的赤道板附近,当子细胞形成时则游离于细胞质中形成不含着丝粒的微核。1.2.2非肽模拟酶检测细胞微核试验和水解反应该物质可以使染色体和纺锤体联结发生障碍或纺锤体功能受损。在细胞分裂时,染色体不发生分离而产生非整倍体子细胞,同时在赤道板中央残留一条或多条染色体,它们在子细胞形成时不能被包在子核中,而游离于细胞质中形成含着丝粒的微核。一般的遗传毒性物质兼有染色体断裂剂和非整倍体剂两方面的作用。RPR-115135是一种新的非肽模拟酶(法尼基转移酶)的抑制剂,在不影响细胞膜完整性的浓度水平诱导微核频率地显著增加。RPR-115135使CREST+与CREST-微核比例显著增加,RPR-115135作为一种非整倍体剂,其作用依赖于肿瘤细胞的调节基因的突变互补,这种活性与ras基因型无关。1.3纤维素在不同给药后微核试验和半胱氨酸对小鼠血清学指标的影响VB12、叶酸缺乏可引起微核。有人对9位健康志愿者进行了叶酸限量试验,从基础用量的195mg/(L·d),减到每天56mg,维持5周,然后,慢慢补充叶酸。减量后的双核淋巴细胞和全系淋巴细胞内的微核频率均增高,且有着丝点阳性和阴性的微核都增加;当叶酸补充后,两类细胞微核率明显下降,着丝点阳性微核变化更为显著。试验表明,低叶酸贫血症在临床贫血症状之前就出现了血液和口腔粘膜细胞遗传物质损伤。当叶酸和VB12的摄入量是基础量的3.5倍时,微核率明显降低。半胱氨酸浓度过高也可引发微核,当血浆中半胱氨酸浓度低于7.5mmol/L时,微核率最低。谷胱甘肽、VC、VE、硒以及抗氧化酶类(如过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶)等具有降低微核产生的能力,主要是它们可以清除体内的超氧化物等物质。GiriA等研究认为,Vc有预防顺铂诱导鼠致畸的作用,联合使用VC和顺铂这两类药物,发现小鼠骨髓细胞微核、染色体畸变等指标明显低于单独使用顺铂。有趣的是,他们还发现联合治疗过程中,鼠骨髓细胞谷胱甘肽(GSH)水平也明显增高,可解释Vc保护细胞免受顺铂诱导畸变的机理。1.4-射线结合应用放射线可以引起DNA损伤,导致微核出现。暴露在超低频磁场对自发和X-射线诱发的微核数无影响。但是在X-射线辐射之后暴露在超低频磁场,在CHO细胞可加速X-射线诱导的整条染色体(或着丝粒片断)的延滞。此外,γ-射线也能够引起明显的微核增加。将老鼠在静磁场中暴露,微核频率显著增加,并且与剂量相关。一些研究者认为,微核数增加可归因于由静磁场引起的应急反应或静磁场的直接断裂与纺锤体干扰效应。2微核技术的发展2.1小鼠双核细胞形态的表现1985年Fenech等建立的方法,用胞质分裂阻滞剂阻断胞质分裂,但不影响细胞核分裂,有丝分裂细胞呈特殊形态的双核细胞,未发生核分裂的细胞则维持单核细胞形态。检测致突变因素作用后的双核细胞率和双核细胞微核率,可同时获得致突变因素对细胞的遗传毒性损害和对细胞周期影响的信息。在胞质阻断微核试验中,会出现核质桥(nucleoplasmicbridges,NPB),NPB是由双着丝粒染色体和有着丝粒的环状染色体在细胞分裂后期形成的。2.2自动微芯检测方法2.2.1流式细胞仪检测mn流式细胞仪(Flowcytometry)检测方法是20世纪70年代发展起来的定量测定细胞和亚细胞成分的方法。流式细胞仪是利用激光束为光源,将待测样品进行荧光染色,然后在液体载体里以单个细胞通过激光束,产生荧光信号并转变为电信号通过仪表显示来达到定量测定的目的。流式细胞仪检测MN有很多优点:①检测速度至少比人工读片快40~100倍。②减少了人为的主观因素。③新型流式细胞仪具有分选功能,对判定为含MN的细胞,可以分类检出并收集在玻片上或试管里,在显微镜下检查验证,以证实其真实性并计算其可置信度。2.2.2计算每点图像时差的定量参数计算机图像分析系统是将高分辨力摄像机和计算机结合起来将图像分解为若干点,再将每个点的图像色差转换为数字信号,储存在计算机里进行各定量参数的计算。从20世纪80年代中期开始利用计算机图像分析技术,其检测速度也至少比人工计算快10倍以上,但容易受条件因素影响,还需进一步完善。3微芯染色组成分析技术3.1荧光原位杂交试验荧光原位杂交(Fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术是近年来开展起来的分子生物学新技术。它是使用生物荧光素标记的各类DNA和RNA探针与细胞或组织在玻片上进行原位杂交,被观察的特定DNA片段(或序列)在荧光显微镜下固定在细胞核或染色体的原有部位显示荧光。利用荧光原位杂交试验可以检测出是染色体断裂还是丢失,以及可以判断是哪一条染色体、哪一段所产生的微核。目前已成功用于MN试验的DNA探针主要有2类:第一类是含DNA重复序列的探针,主要用于检测染色体着丝粒的DNA;第二类是含染色体端粒DNA序列的探针,它主要显示染色体臂的存在。若2种探针结合使用,则可以较为准确地判断MN的组成情况,即是染色体段片还是整条染色体,以及各自的数目。目前,在原位杂交的基础上又发展出了多彩色荧光原位杂交技术,它使用几种不同的荧光素单独或混合标记的探针进行原位杂交,在荧光显微镜下显现不同的颜色,因而可以同时检测间期或中期细胞中的几个特异核酸序列。它可以广泛应用于物理图谱绘制、致突变研究、肿瘤病理和产前诊断等方面。3.2种自动抗体(CREST染色)抗着丝粒抗体(Anti-kinetochoreantibodies)是美国学者Moroi及其同事于1980年在硬皮病病人血清中发现的一种自动抗体,这些自动抗体可以通过免疫荧光技术检测到。它们与染色体着丝粒蛋白(抗原)成分相结合,具有较强的特异性。但并非所有硬皮病病人的血清中都含有该自动抗体,含该抗体的病人皮肤损害往往并不严重和广泛,但却有显著的CREST征。所以,将用该种病人的血清对染色体着丝粒的染色直接称为CREST染色(CRESTstaining)。CREST染色用来区分MN来源(染色体断片还是整条染色体),了解诱导MN的化合物性质(断裂剂还是整倍体剂)。4为行政管理部门服务微核试验广泛应用于药品、食品添加剂、农药、化妆品、工业化学品、环境污染物等遗传毒性的检测、安全性评价和遗传损害的监测,为接触有害物质的人群提供遗传损害检测和工作环境监测,为行政管理部门的决策、立法奠定理论依据。4.1走恶势力环境检测污染物对人体或生物产生的损害可以方便快速地通过微核检测出来。在普查致畸、致癌、致突变物等方面应用广泛,如物理因子(射线)、化学因子(毒物)、生物因子(毒素),空气中污染的气体,工业、生活污水,洗涤剂,重金属,农药等致突变物的检测。目前全世界已检出的有毒物质近500种。蚕豆根尖微核技术作为水污染检测方法,早在1988年就被国家环保局批准,由许多研究表明,蚕豆根尖微核技术在检测流域或湖泊水污染方面,有非常好的效果,有关这方面的研究较多。4.2细胞微核检测化疗后机体的淋巴细胞及骨髓细胞微核率会明显上升,这些可以反映化疗后的遗传损伤程度。E1ias-L等对15例化疗或放疗急淋儿童外周血淋巴细胞微核变化进行分析,用长春新碱、甲基喋啉、柔红霉素、强的松化疗和首次强化疗末期使用了头部放疗的病人,他们的淋巴细胞微核明显高于对照组,6例作了2年治疗期动态观察,多数病人治疗期淋巴细胞微核频率显著增高。因而认为,微核检测法是评价抗白血病化疗药物诱导机体细胞遗传学损伤的有效方法。微核是遗传损害的生物标志物,用于癌症患者、肿瘤患者等放射剂量的估算及放射事故的事后遗传损伤检测。有文献介绍,用细胞阻断微核分析法评价放射治疗8位病人后的淋巴细胞辐射线损伤情况,结果治疗后,每500个双核细胞的微核平均值明显高于治疗前的对照细胞。4.3小鼠骨髓异常病变反应mds的诊断价值在诱变因子和致癌物下的特定人群的血液淋巴细胞和上皮细胞的微核率会明显上升。通过上皮细胞的微核数量变化可快速安全地早期检测癌变或预报受损伤程度。大连医科大学第二临床学院检验科王永才教授主持的一项课题“微核测定和DNA含量分析对骨髓异常增生综合征(MDS)早期诊断的应用研究”,在患者临床无任何症状,恶性细胞出现之前即可快速、准确地预测MDS。骨髓异常增生综合征(MDS)又称白血病前期,其中约30%的MDS可演变成白血病。淋巴细胞微核检测是一种快速敏感的测定机体损伤的早期生物学反映指标,也是肿瘤早期检测的诊断指标。4.4用于肺癌药物的断剂将待测物质用微核检测方法进行分析,根据微核率发生情况来判断物质的抗癌性。该方法已经进行了一些研究,有望应用于抗癌药物的筛选。此外,有人将微核技术与荧光分光法结合起来,研究小分子对DNA的作用,从而筛选对癌细胞有作用的药物分子。4.5影响本地植物的地球化学目前,微核技术已经用于研究外来生物,如紫茎泽兰、微甘菊等分泌的化学物质对本地其他植物的影响。通过蚕豆根尖微核试验表