姜黄素不同给药途径在大鼠体内的药代动力学和绝对生物利用度研究

姜黄素不同给药途径在大鼠体内的药代动力学和绝对生物利用度研究

姜黄素是姜科天南星科植物的提取物。这是植物种类很少的第一种二醇色素。姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化、抗肝细胞毒性、抗风湿、抑菌等广泛的药理作用。姜黄素在水中溶解度低,血浆半衰期很短,血药浓度低,口服不易吸收,生物利用度低。而具有生物活性的化合物能否在生物体内发挥效应,很大程度上取决于血浆中药物浓度和生物利用度。曾有文献报道过姜黄素的口服生物利用度低,但缺乏其具体数据及其它给药途径的绝对生物利用度资料。本实验测定不同给药途径下大鼠血浆中姜黄素的浓度,从而研究姜黄素的药代动力学过程,计算口服以及腹腔注射姜黄素的生物利用度,为姜黄素不同剂型的制备以及临床应用提供理论依据。1材料表面1.1g3a自动进样器高效液相色谱仪为Agilent1100系列,包括G1322A在线脱气机,G1311A四元泵,G1313A自动进样器,G1316A温控箱,G1315B二极管阵列检测器和Agilent化学工作站(RevB.08.04.)。电子分析天平(AB204-A,梅特勒-托利多上海仪器公司);涡旋混合器(XK96-B,姜堰市新康医疗器械有限公司);氮吹仪(D10型,杭州蓝焰科技有限公司)。1.2实验用水及设备甲醇和乙腈为一级色谱纯,三氟乙酸(Sigma,064K3647),乙酸乙酯、氢氧化钠均为分析纯;实验用水为娃哈哈纯净水。姜黄素对照品(上海融禾医药科技有限公司,含量98.7%,070912);AF2364对照品(美国洛克菲勒大学提供,含量99.6%)。1.3动物21只♂SD大鼠,体质量(230±20)g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,动物许可证号:SCXK(沪)2007-0005。2方法2.1给药方案2.1.1配制0.0.2%-1标准溶液灌胃给药溶液:用5%DMSO-玉米油溶解,配制成200mg·kg-1混悬液,临用前配制。静脉给药溶液:用10%DMSO-生理盐水溶解,配制成10mg·kg-1澄清液,临用前配制。腹腔注射给药溶液:用10%DMSO-生理盐水溶解,配制成20mg·kg-1澄清液,临用前配制。2.1.2灌胃后不同给药时间将21只大鼠随机分成3组,给药前每组均禁食12h(不禁水),分别舌下静脉(10mg·kg-1)、灌胃(200mg·kg-1)和腹腔注射(20mg·kg-1)给药。静脉给药后分别于5、8、10、15、20、25、35、45、60、120、180min尾静脉取血;灌胃组分别于给药后10、15、25、35、45、60、120、180、240、300、360min尾静脉取血;腹腔注射组分别于给药后10、15、25、35、45、60、120、180、240min尾静脉取血。采血0.6ml注入肝素化的试管,离心(3000r·min-1)取血浆,-40℃冰冻保存备测。2.2对照溶液的制备2.2.1姜黄素标准储备液的制备准确称取姜黄素标准对照品25mg于25ml容量瓶中,用甲醇溶解定容至25ml,得浓度为1g·L-1的姜黄素标准储备液;用甲醇稀释成浓度依次为100、10、1mg·L-1的标准工作液(临用前稀释)。2.2.2标准储备液af2364的制备准确称取AF2364标准对照品25mg于25ml容量瓶中,用甲醇溶解定容至25ml,得浓度为1g·L-1的AF2364标准储备液;用甲醇稀释成浓度为100mg·L-1的AF2364内标工作溶液。2.3活性化合物的制备准确吸取待测血浆样品0.3ml于10ml具塞试管中,加入100mg·L-1的AF2364内标工作液50μl,混匀后加入0.01mol·L-1氢氧化钠溶液200μl。再加入乙酸乙酯3.0ml,漩涡混匀2min。转移上层有机相于另一刻度离心管中,氮吹仪中吹干。用200μl流动相复溶,取复溶液于自动进样器的样品瓶中,设定10μl进样检测。2.4保护柱、流动相、温度色谱柱:ZORBAXSB-C18(4.6mm×150mm,5μm,Agilent,USA);保护柱:SB-C18保护柱(4.6mm×12.5mm,5μm,Agilent,USA);流动相:乙腈∶水∶0.1%TFA=50∶30∶20(V/V/V);流速:1.0ml·min-1;柱温:35℃;检测波长:302nm(0～5.5min),422nm(5.5～7.5min)。2.5数据分析采用DAS2.0药动学软件处理血药浓度-时间数据,得到姜黄素的药代动力学参数,并计算其腹腔注射和口服的绝对生物利用度。3标准曲线及定量下限空白血浆、姜黄素血浆标准品以及大鼠血浆样品,经HPLC分析测定得到的色谱图见Fig1。由图可见在本实验条件下,姜黄素与内标能完全分离,血浆中内源性物质不干扰姜黄素和内标的检测;姜黄素的保留时间为6.7min,内标的保留时间为4.4min。A:Blankplasma;B:Plasmaspikedwithcurcumin(4mg·L-1)andinternalstandard;C:Ratplasmasample0.5hafterintravenouslyinjection(0.565mg·L-1);1:internalstandard;2:curcumin配成浓度相当于0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00mg·L-1的姜黄素血浆标准品溶液,再按“2.3”项处理后检测,测定姜黄素峰面积As、内标峰面积Ai,以As/Ai为纵坐标(Y),以所对应各点浓度C为横坐标(X)绘制标准曲线。得姜黄素的标准曲线回归方程为Yˆ=0.3186X−0.0012(r=0.9998)Y^=0.3186X-0.0012(r=0.9998)。定量下限为0.05mg·L-1(n=6;RSD=5.21%)。3.3冻融条件对血浆中姜黄素的检测配制低、中、高3种浓度(0.10、1.00、4.00mg·L-1)的姜黄素血浆标准品溶液,每种浓度6份,再按“2.3”项处理后检测。依据标准曲线计算各自的浓度,低、中、高3种浓度的相对回收率分别为(99.29±5.40)%、(104.21±4.72)%、(99.83±1.97)%。配制低、中、高3种浓度(0.10、1.00、4.00mg·L-1)的姜黄素血浆标准品溶液,每种浓度6份,再按“2.3”项处理后检测,记录姜黄素的峰面积,为血浆标准的峰面积。另取锥底试管6支,两个一组;每组加入与配制血浆标准品溶液相同的姜黄素标准品溶液,直接吹干后用流动相200μl复溶,10μl进样检测;记录不同浓度姜黄素的峰面积,为该浓度的纯标准品的峰面积。计算血浆标准的峰面积与纯标的峰面积的比值,即为绝对回收率,绝对回收率分别为(77.18±3.48)%、(77.84±1.22)%、(78.25±0.81)%。配制低、中、高3种浓度(0.10、1.00、4.00mg·L-1)的姜黄素血浆标准品溶液,每种浓度6份,再按“2.3”项处理后于同一日内测定,依据当日标准曲线计算检测量,计算日内精密度;连续3d同样操作,计算日间精密度。结果上述方法测得的日内和日间RSD均小于10%,符合生物分析方法指导原则的要求。配制低、中、高3个浓度(0.10、1.00、4.00mg·L-1)的姜黄素血浆标准溶液,每种浓度3份;经历3次冰冻-解冻循环后,按“2.3”项处理检测,考察其稳定性。低、中、高3个浓度的RSD分别为4.92%、4.56%、0.65%,结果显示冻融条件对血浆样品的检测结果没有明显的影响。7只大鼠单剂量iv10mg·kg-1姜黄素后,血药浓度-时间曲线见Fig2A;7只大鼠单剂量ip20mg·kg-1姜黄素后,血药浓度-时间曲线见Fig2B;7只大鼠单剂量ig200mg·kg-1姜黄素后,血药浓度-时间曲线见Fig2C。血浆药物浓度经DAS程序处理,姜黄素在大鼠体内iv、ip和ig给药后的药代动力学参数见Tab1。并根据下式计算姜黄素在大鼠体内的绝对生物利用度:F/%=(AUC血管外给药·D静脉注射)/(AUC静脉注射·D血管外给药)×100%。经计算姜黄素在大鼠体内,口服给药绝对生物利用度为4.13%,腹腔注射给药的绝对生物利用度为35.07%。关于血浆姜黄素的检测,一般采用HPLC-UV的方法。姜黄素在整个紫外区均有良好的吸收,二极管阵列检测器(DAD)三维立体图显示,姜黄素的最大吸收波长在426nm处。本研究使用AF2364做内标,最大吸收波长在302nm处,故采用DAD波长梯度的功能,在0～5.5min使用302nm波长检测AF2364,5.5～7.5min使用426nm波长检测姜黄素,获得了良好的色谱峰。通过静脉注射、腹腔注射和灌胃3种给药途径药动学结果来看,姜黄素静脉给药后,大鼠体内代谢迅速。本实验结果显示姜黄素静脉给药的消除半衰期为(11.96±2.64)min,与灌胃给药的消除半衰期(90.79±11.55)min、腹腔注射给药的消除半衰期(159.28±18.12)min差异均有显著性(P<0.05)。同时从药时曲线分布相可知,静注后血药浓度几分钟内就迅速下降了几倍,这可能是姜黄素经静注后迅速向各脏器分布。大鼠分别经灌胃(200mg·kg-1)、腹腔注射(20mg·kg-1)、舌下静脉(10mg·kg-1)给予姜黄素后,其Cmax分别为(3.58±0.58)mg·L-1、(1.01±0.12)mg·L-1、(0.67±0.06)mg·L-1,可以为姜黄素在不同给药途径下的药效学研究提供给药剂量的参考。本实验结果显示,口服姜黄素的生物利用度达4.13%,腹腔注射姜黄素的生物利用度为35.07%,与文献报道,姜黄素大鼠口服吸收很低一致。腹腔给药后,部分姜黄素未被吸收,可能与腹腔内的血流量有关,也可能是非水溶液在腹腔内局部滞留、吸收缓慢;腹腔给药后的AUC明显大于灌胃给药AUC,说明姜黄素口服后极少原形