酶联、放射免疫测定2011.12

酶联免疫吸附测定技术

(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）

放射免疫测定技术

（radioimmunoassay,RIA）张缨-运动生化教研室一、概论（一）标记的免疫技术免疫技术：抗原抗体反应标记物：放射性同位素、酶、荧光素三大标记技术放射免疫测定、荧光抗体技术、酶免疫测定应用：免疫组织化学免疫测定（二）ELISA方法类型夹心法间接法竞争法EE终止液标本酶标抗体底物显色显色固相固相标本酶标二抗底物1.夹心法2.间接法3.竞争法（基本原理）非标记抗原Ag（antigen）标记的相同抗原Ag*一定量特异性抗体Ab(antibody)

Ag＋Ab

Ag-Ab

Ag*＋AbAg*-Ab

Y

固相抗体

抗原量结合百分数竞争结合抑制曲线标准曲线的类型

B/B0%B/B0%1.以测定物标准品浓度为横坐标，B/B0%为纵坐标，呈双曲函数；2.以测定物标准品浓度的自然对数为横坐标，B/B0%为纵坐标，呈反S型函数；3.以标准品浓度的自然对数为横坐标，LogitB/B0为纵坐标，标准曲线为从左到右的渐降直线。（3）（3）B/B0=（B-NSB）/（B0-NSB)B：各标准品或样品OD值B0：浓度为0的标准品的OD值NSB：空白孔LogitB/B0=ln（B/B0）/(1-B/B0)标准品浓度（pg/ml）：S0=0；S1=50；S2=100；S3=250；S4=500；S6=1000二、发展史1941年，Coons建立了荧光素标记抗体技术，定位组织和细胞中；1955年Berson、Yalow在研究胰岛素时创立放射免疫技术，1977年该技术被授予诺贝尔奖；缺点：应用放射性同位素，对人体有一定危害1966年，美国的Nakane和Pierce以及法国的Avrameas和Uriel同时报道了酶免疫测定技术。其将酶替代荧光素，用于抗原在组织中的定位。60年代末，在酶免疫组织化学的基础上，发展了一种酶标固相免疫测定技术。酶联和放免测定优点灵敏度高：10-9－10-12克，毫微克-微微克水平（ng-pg）；特异性强：抗原-抗体反应；准确性好：解决了以前难以测定的微量生物活性物质如激素的临床检测问题；操作简便：三、酶联免疫测定技术（一）必备试剂固相的Ag或Ab----免疫吸附剂酶标记的Ab或Ag----结合物酶反应的底物-------底物1.免疫吸附剂（1）固相载体

要求：①吸附力强②能保持Ag或Ab活性③不参与化学反应

⑵常用载体

材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等形状：小试管、小珠、微量反应板（酶标板）（3）Ag或Ab

纯度高、效价高、结合力高（4）免疫吸附剂制备(固相Ag或Ab)

包被：将Ag或Ab固相化的过程如：包被抗体：酶联板每孔加100µL抗体缓冲液，4℃过夜；甩净。封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰。2.酶结合物（1）酶的要求

纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。

（2）ELISA常用酶

辣根过氧化物酶（HRP）

碱性磷酸酶（AP）、ß-半乳糖苷酶等

（3）酶的底物

HRP可溶性底物及呈色：

邻苯二胺(OPD)：橙红(429nm)

四甲基联苯胺(TMB)：黄色(450nm)5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)鲁咪诺+H2O2：荧光HRP不可溶性底物及呈色：

DAB(棕黄色)，α-萘酚(红色)，3-氧基-9-乙基卡唑(红色)4-氯-1-萘酚(灰蓝色)AP可溶性底物及呈色：

对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光Ap不可溶性底物及呈色：

NBT和BCIP混合液：紫色坚固红和萘酚ASMX混合液：红色ß-半乳糖苷酶：

4-甲基伞基-ß-半乳糖苷：荧光（4）酶结合物的制备A戊二醛交联法B过碘酸盐氧化法（二）操作标准化

1加样2保温3洗涤4比色

（三）举例血清IL-6浓度的测定1.试剂盒：（1）抗体酶标板1个（96孔可拆）（2）抗原标准品6瓶：标准品浓度（pg/ml）：S0=0；S1=50；S2=100；S3=250；S4=500；S6=1000（3）酶标记抗原溶液1瓶（4）底物A和B各1瓶（5）洗涤液1瓶（1;100稀释）2.实验操作步骤（1）从冰箱取出试剂，室温20-25度放置15-30分；（2）取出酶标板加样ul空白S0S1S2S3S4S5样本标准品--100100100100100100--血清--------------100蒸馏水100--------------酶标抗原--50505050505050

37度孵育1小时（水浴箱）充分洗涤酶标板，每空加200，放2分钟，洗3次，吸水纸彻底排干底物A--50505050505050底物B-