体内药分的设计与评价

第三章体内药物分析方法的建立与确证

药物分析教研室

设计依据建立的一般步骤验证的内容与要求DistributionMetabolismAbsorptionExcretion第一节分析方法的设计依据

体内药物分析方法的选择，一般根据药物的结构、理化性质、体内药物浓度大小、干扰成分的多少，样品的预处理方法、试验条件和目的等因素综合考虑，方可选择出供生物样品中药物及其代谢物含量测定的分析方法。1.测定药时曲线

药-时曲线C-T(Concentration-Timecurve)

以时间为横坐标，药物的一些特征数量（如体内药量、血药浓度、尿药排泄速度、累积尿药量等）为纵坐标绘制的曲线（一）明确分析方法设计的目的要求（一）明确分析方法设计的目的要求

◦

——◦口服；•——•静脉注射给予650mg阿司匹林后的药-时曲线比较

生物利用度(Bioavailability)：剂型中的药物被吸收进入血液的速率和程度。生物等效性(Bioequivalence)：一种药物的不同制剂在相同的试验条件下，给以相同的剂量，反映其吸收速率和程度的主要动力学参数没有明显的统计学差异。（一）明确分析方法设计的目的要求

“首选色谱法，如HPLC、GC以及GC-MS、LC-MS、LC-MS/MS联用技术。一般采用内标法定量，必要时采用生物学方法或生物化学方法。”——《中国药典》2010版检测 ——宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)方法 ——不必强调方法的简便、快速

（一）明确分析方法设计的目的要求（一）明确分析方法设计的目的要求2.药代动力学研究要求

——同时测定原形药物和代谢产物检测

——宽线性范围高灵敏度(ng、pg级)

高专属性(原形药物及其代谢产物的分离)原形药物和活性代谢物同时存在可能对测定浓度的准确性产生影响（一）明确分析方法设计的目的要求例：环孢霉素A监测测定结果荧光偏振免疫法比高效液相色谱法约高30%，临床调整剂量时，必须参照各自的有效血药浓度标准进行（一）明确分析方法设计的目的要求3.临床药物监测TDM(TherapeuticDrugMonitoring)单剂量给药后的时-效曲线

方法——尽量简便、易行；适用于长期、批量样品测定——大多采用UV、RIA或EIA等（二）调研文献了解待测药物的特性

已报道药物的测定，应综览文献，掌握已解决和尚在的问题，同时获得待测药物的详细理化特性及其在体内的代谢情况。文献报道方法只可借鉴，不可生搬硬套！无文献报道的新药品，根据新药的化学结构，理化特性，在体内存在的状态及代谢情况，参考同类型药物的文献资料，设计全新的方法。（二）调研文献了解待测药物的特性1.待测药物的理化性质药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等——预处理及检测方法

具有亲脂性——在适当的pH值下用溶剂萃取

具有强极性或亲水性——沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等

具有挥发性——GC测定法

具有光谱或电化学特性——分析检测方法

药物的稳定性——萃取浓缩技术

对酸碱不稳定——避免使用强酸或强碱性溶剂

对热不稳定——避免高温蒸发溶剂对光不稳定——避免见光2.体内存在状态及其代谢情况（二）调研文献了解待测药物的特性与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低

——分离萃取方法

蛋白结合较强——不宜直接采用溶剂萃取体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物浓度较低（尤其有代谢产物共存）

——代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定

——采用LC-MS、EIA等分析检测技术（三）仪器设备与实验室条件

根据实验室现有的仪器设备和可能获得的装备加以考虑，然后考虑有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。第二节方法建立的一般步骤文献调研拟定初步分析方法分析条件优化分析条件验证体外试验体内样品测定（一）检测条件的筛选

取一定量待测物或代谢物纯品，按所拟定的分析方法进行体外测定，求得待测药物浓度与仪器响应值之间的关系；浓度线性范围；最佳检测浓度；仪器检测的灵敏度及测定的最佳条件。HPLC

——调整检测器(类型、条件)

色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒径、柱长度)

流动相(组分及其配比)及其流速

柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等——使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ)

良好的色谱参数(n、R、T)

适当的保留时间(tR)（一）检测条件的筛选（二）分离条件的筛选1.以水代替空白样品添加标准品测定水＋标准品溶液样品前处理考察——

提取回收率、LOD、萃取溶剂、溶液pH值、挥发浓缩等条件。2.以处理过的空白样品进行测定要求——在待测药物、代谢物、内标物的“信号窗”无内源性物质信号。

空白不干扰样品的测定！（二）分离条件的筛选3.以空白样品添加标准品测定考察——线性范围、精密度、准确度、灵敏度、回收率、特异性等指标。加入标准溶液加入空白生物基质涡旋混匀4.体内实际样品的测定（二）分离条件的筛选

已确定的分析方法及其条件不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试

——药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物)

考察

——代谢产物对药物、内标物的干扰情况

——进一步验证方法的可行性第三节分析方法验证的内容与要求

AccuracyPrecisionSpecificitySensitivityReproducibility

RecoveryMatrixEffectQualitycontrolStabilityCalibrationCurve&Range《药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则》——《中国药典》二部《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》——【H】GCL1-2《化学药物制剂人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》

——【H】GCL2-1（一）特异性(Specificity)

必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特定活性代谢物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得干扰对样品的测定，如果有几个分析物，应保证每一个分析物都不被干扰。应确定保证分析方法的最佳检测条件对于色谱法至少要考察6个不同个体的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图，以反映分析方法的特异性。对于以软电离质谱为基础的检测法（LC-MS、LC-MS-MS）应注意考察分析过程中的介质效应，如离子抑制等。（一）特异性(Specificity)空白血浆丹参酮ⅡA加入空白血浆健康受试者服药2h后血浆样品丹参酮ⅡA丹参酮ⅡA内标（一）特异性(Specificity)

左旋多巴内源性物质左旋多巴甲酯（二）标准曲线和定量范围（CalibrationCurve&Range）试验报告(论文)中应提供:标准曲线标准曲线线性范围标准曲线的相关系数标准曲线线性范围最低和最高浓度样品的色谱图5.空白生物样品外加被试药物(低,中,高三个浓度;n>5)经标准曲线的反算(back-calculated)测定浓度（二）标准曲线和定量范围（CalibrationCurve&Range）C=0.002～0.2ug/mlC=0.2～10.0ug/ml

必须用至少6个浓度建立标准曲线(n=/>5);应使用与待测样品相同的生物介质;定量范围要能覆盖全部待测浓度;不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点。（二）标准曲线和定量范围（CalibrationCurve&Range）（三）定量下限（LowerLimitofquantitation，LLOQ）

定量下限是标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。LLOQ应能满足测定3～5个消除半衰期时样品中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10～1/20的药物浓度。其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内，相对标准差(RSD)应小于20%。至少应由5个标准样品测试结果证明。（四）准确度和精密度（Accuracy&Precision）

一般要求选择高、中、低3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度通常选择在LLOQ的3倍以内；高浓度接近于标准曲线的上限；中间选一个浓度。在测定批内精密度时，每一浓度至少制备并测定5个样品。为获得批间精密度，应在不同天连续制备并测定，至少有连续3个分析批（不少于45个样品）的结果合格。（四）准确度和精密度（Accuracy&Precision）1.00n=510.0+血浆

n=550.0n=5同一天Inter-Day1次/日;连测5天Intra-Day3*5=15分析批同一批连续三批Inter-BatchIntra-Batch（五）稳定性（Stability）标准溶液短期室温长期低温(-4℃,-20℃)生物样品短期室温长期低温(-20℃,-70℃)反复冷冻－解冻（六）提取回收率（ExtractionRecovery）从生物样本基质中回收得到分析物质的响应值除以标准品产生的响应值即为分析物的提取回收率。也可以说是将供试生物样品中分析物提取出来供分析的比例。考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应精密并具有可重现性。

考察生物样品预处理过程造成的药物损失程度（六）提取回收率（ExtractionRecovery）回收率(%)=A测/A真×100%A测：被测药物标准品加入空白样品中，按设定方法处理、进样测定，测得的色谱峰面积A真：纯品溶剂溶解并稀释使其浓度与第一份处理后浓度一致，进样测得的色谱峰面积

A测=A药/A内×100%

A真=A药’/A内’×100%内标法0.5mlPlasmaSample50μlIS50μl混匀碱化乙酸乙酯

5ml涡旋3min3500rpm离心8min上清液4ml氮气吹干残渣物MP复溶200μl20μl上清液进样分析（六）提取回收率（ExtractionRecovery）0.5mlPlasmaSample50μlIS50μl混匀1.5mlMeOH涡旋

1min16000rpm

离心8min

20μl

上清液进样分析（六）提取回收率（ExtractionRecovery）（七）基质效应