分子生物学与生物化学实验操作设计与技能(7-2)

分子生物学与生物化学实验

操作、设计与技能

几种重要的PCR技术(一)

李刚副教授几种重要的PCR技术

差异显示PCR3RT－PCR；1出错PCR（致突变PCR）45‘－RACE和3’－RACEPCR；2OE－PCR5RT-PCR概述（1）RT-PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

RT-PCR概述（2）首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。常见的三种反转录酶特性1、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）与鼠白血病病毒勒尼株（Mo－MLV）来源的中温酶。AMV来源的反转录酶具有高活性的RNaseH,这种高活性RNaseH趋向于抑制cDNA的产生限制其合成长度。Mo－MLV来源的反转录酶更适合RT－PCR，因为它的RNaseH活性较弱。但它催化反应的最适温度为37度，较AMV反转录酶的42度为低，因而对于具有高度二级结构的RNA模板可能会带来稍微不利的影响。2、缺乏RNaseH活性的Mo－MLV反转录酶的突变体。这些酶较野生型酶对模板RNA分子的转录效率更高，合成cDNA分子的长度更长。此外，还能在更高温度下合成cDNA（高达50度），这对于容易折叠成二级结构的RNA模板更为有利。3、嗜热热稳定TthDNA聚合酶，这种酶在RT－PCR中的主要优点：它能在反转录与扩增两个阶段均起作用，实验在同一个反应管内进行。但这种酶功不抵过，一方面这种酶合成的cDNA平均长度仅为1－2kb,它短于Mo－MLV反转录合成的cDNA长度（约10kb）；此外，Mn2＋的存在会造成DNA合成的低保真度也是令人担心的地方。最后，该酶不能用Oligo(dT)或随机六核苷酸作为引物，因为它的催化反应的最适温度下这两种引物不能与RNA模板形成稳定的杂合体。RT－PCR的用途

（Reversetranscriptase-PCR）反转录PCR是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。RT－PCR对于获得克隆mRNA的5‘、3’末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏和通用的方法。此外，RT－PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性；还可用于测定基因表达的强度，尤其是在可获得mRNA数量有限和目的基因表达水平很低时即可用RT－PCR方法分析。RT－PCR的原理RT-PCR是一种从细胞RNA（mRNA）中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法，它由两大步骤组成：一步是反转录（RT），另一步是PCR。反转录的起始材料可以用总RNA，也可以用mRNA。首先，在反转录酶作用下将RNA（mRNA）反转录成cDNA第一链，即以oligo(dT)、随机六寡核苷酸或基因特异序列为引物与mRNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶（反转录酶）催化合成相应互补的cDNA链。以该cDNA第一链为模板，即可进行PCR扩增。根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物，基因特异的上游引物与cDNA第一链退火，在TaqDNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。

RT-PCR原理示意图

RT－PCR的两种操作方法1、一步法（OneStep）。RNA－cDNA－PCR反应操作在同一反应体系中进行，反应中途不需要添加任何试剂，就可以完成由AMV由来的反转录酶从RNA反转录为cDNA,再由AMV－OptimizedTaq扩增cDNA的全部反应。一般试剂盒中含有进行onestep法RT－PCR反应用的全部试剂，可以简便有效地对RNA进行扩增分析。2、两步法（TwoStep）。首先进行RNA－cDNA反应，然后再进行DNA－PCR的反应。整个RT－PCR分两步进行。一般扩增的效率或保真度比一步法高。一步法和两步法的比较一步法与两步法的最大区别在于RT和PCR在同一个管子中进行。与两步法相比，一步扩增法不仅简单、有效，简化了整个RT-PCR的步骤，并且最大程度上避免了样品的污染。此外，一步法在检测低丰度mRNA的表达时比常规RT-PCR更具优势，一步RT-PCR法可从少至10pg总RNA中检测出基因的表达。但当分析很多基因在少量不同RNA样品表达时，两步法也不失为一种较好的方法。此外，在避免样品污染的情况下，两步法的扩增效果经常要比一步法好。一步法操作步骤（1）

（以TaKaRa公司TaKaRaOneStepRNAPCRKit为例）1、按下列组成配制RT－PCR反应液。10×OnestepRNAPCRbuffer5lMgCl2(25mM)10ldNTPMixture(各10mM)5lRNaseinhibitor(40U/l)1lAMVRTaseXL(5U/l)1lAMV-optimizedTaq(5U/l)1l上游特异性引物（20M）1l下游特异性引物（20M）1lPositiveControlRNA或实验样品（1gtotalRNA）*1lRNaseFreedH2O24lTotal50l/sample*当目的RNA的表达量较少时，可加至25，同时在反应体系中相应地减少水的量。一步法操作步骤（2）

（以TaKaRa公司TaKaRaOneStepRNAPCRKit为例）按以下条件进行RT－PCR反应：50C30minRT反应94C2minRTase失活94C30sec37-65C30secPCR反应25－30cycles72C1-10min一步法操作步骤（3）（以TaKaRa公司TaKaRaOneStepRNAPCRKit为例）反应结束后，取PCR反应液（5－10l）进行琼脂糖凝胶电泳，确认RT－PCR反应产物，并将剩下的冷冻保存。两步法操作步骤（1）（以TaKaRa公司TaKaRaRNAPCRKit（AMV）Ver.3.0为例）A反转录反应合成cDNA引物可结合实际情况从OligodT、随机性引物或特异性引物中任选一种。1、按下列组成配制反转录反应液。10＊RNAPCRbuffer1lMgCl2(25mM)2ldNTPMixture(各10mM)1lRNaseinhibitor(40U/l)0.5lAMVReversetranscriptase1l下游特异性引物（20M）0.5lPositiveControlRNA或实验样品（500ngtotalRNA）1lRNaseFreedH2O3.75lTotal10l/sanple此反应体系已添加足够dNTP,PCR反应时不需要再添加dNTP。两步法操作步骤（2）（以TaKaRa公司TaKaRaRNAPCRKit（AMV）Ver.3.0为例）按以下条件进行反转录反应：42－55C15－30minRT反应99C5minRTase失活5C5min两步法操作步骤（3）（以TaKaRa公司TaKaRaRNAPCRKit（AMV）Ver.3.0为例）1、按下列组成配制PCR反应液：上游特异性引物（20M）0.5l下游特异性引物（20M）0.5l5＊PCRbuffer10lTaKaRaExtaqHS0.25ldH2O28.75lTotal:40l/sample2、把1的反应液加入A－2反转录结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。3、按以下条件进行PCR反应：94C2min1cycle94C30sec50-60C30secPCR反应25－35cycles72C0.5-4min4、反应结束后，取反应液（5－10l）进行电泳，剩下的冷冻保存。RT－PCR产品推荐1、TaKaRa公司系列产品；2、Promega公司系列产品；RT-PCR操作视频RNA提取和RT-PCR实验.flvRT-PCR的几点注意事项RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。

要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。

2.RT按要求做，一般不会出太大问题。

3.PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能