分子生物技术在土壤微生物研究中的应用

分子生物技术在土壤微生物研究中的应用

矿的开发及其矿的清洗和加工会污染当地的气候、水和土壤。对矿区大气、水体以及土壤的修复治理是矿区生态恢复的一项重要内容。矿业废弃地往往含有多种污染物,如重金属、有害的选矿物料(如剧毒的氰化物等)。污染物通过大气和水体等途径广为扩散,严重污染矿区周边地区,使矿区周边土壤微生物多样性下降,造成土壤质量下降和土壤微环境的破坏。矿区废弃地的生态恢复,是在废弃地生态系统自然演替过程与机理等理论研究基础上,建立相应的技术体系,用以指导恢复矿业活动所造成的生态破坏。目前,对污染土壤微生物多样性方面的研究仍较薄弱。一方面是由于测定微生物结构和功能等的方法技术还不是很成熟,不能系统、全面地研究土壤微生物多样性变化;另一方面是因为土壤环境的微观性和高度异质性。此外,土壤环境中微生物种类繁多、个体微小、群落结构变化复杂和对环境变化敏感等因素都是造成土壤微生物研究缓慢的原因。随着分子生物学的发展,分子生物技术的应用把微生物学研究逐步提高到动态、定量、定位和定立体构象等全新的研究水平上,突破了传统技术手段的局限性,使土壤微生物不经培养,直接通过对其遗传物质的分析来检测微生物物种和群落等的变化。如,在土壤微生物群落结构的研究中,基于DNA或RNA信息的分子生物学方法显示出了很好的应用前景。1与矿区土壤中污染物有关的分子生物技术1.1对重金属污染农田土壤微生物多样性的影响PCR-DGGE技术是通过从环境样品中提取基因组DNA,利用PCR扩增技术,使目的基因组DNA得到扩增,将扩增后的产物加到有变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,使部分解链的双链DNA片段分开,形成不同的单链DNA谱带,最后回收DNA谱带,同基因文库中的16SrDNA序列进行比对,确定微生物的种属。此项技术最先用于研究土壤微生物基因多样性,现被证实该法能准确地反映土壤微生物的多样性,并广泛地应用于污染土壤微生物多样性的研究。Kozdroj等应用PCR-DGGE和磷脂脂肪酸甲酯(FAME)法研究了重工业污染区耕地微生物群落变化情况,该地区Pb、Cd、Zn污染严重,PCR-DGGE指纹出现不同结果与污染程度相关,主要微生物类群受到影响。Ellis等结合PCR-DGGE与FAME等非培养技术与平板培养技术研究了长期遭受重金属污染的农田土壤微生物多样性,结果发现重金属污染会明显影响土壤中细菌的生理生化特性,但对它们的遗传多样性并没有明显的影响。Leys等研究了多环芳香烃类物质(PAH)对土壤Sphingomonas属细菌多样性的影响,发现PAH能够明显降低土壤中Sphingomonas属细菌的多样性,还会造成新的Sphingomonas属新种的出现。1.2生物多样性变化cDNA文库法是以mRNA为模板,在反转录酶作用下形成互补DNA,每个克隆只含有一种mRNA信息,土壤中全部微生物所包含全部mRNA信息。由于该方法可以保存物种的基因资源,所以通过对正常土壤微生物资源进行cDNA分析,获得物种信息,在与污染土壤比较过程中可以准确地发现物种变化情况。Smit等用扩增性rDNA限制性酶切片段分析(ARDRA)方法结合正常土壤中cDNA相关信息,研究了土壤中Cu对微生物多样性的影响,通过ARDRA图谱和cDNA文库信息综合分析表明污染土壤中微生物多样性明显降低,群落结构发生很大变化。王啸波等利用cDNA文库研究对取自北京造纸七厂污染土壤的分析中发现污染土壤中的微生物为适应污染环境对污染物耐受程度增强导致基因的定向突变。1.3土壤微生物群落结构的测定通过提取和分离指示性PLFA(活体细胞膜的重要成分,恒定出现在同一类环境微生物中),测定他们的含量,定量反映可繁殖或具有潜在繁殖力的不同类群环境微生物生物量和总生物量。微生物的群落结构是衡量环境微生物变化的一个重要指标,在土壤环境中微生物总量不变时,很难判断微生物群落结构的变化情况。PLFA方法能用于这种情况下的微生物群落结构的检测,但是这种检测只是针对在数量上占优势的土壤微生物群落。廖继佩等用PLFA方法得出锌污染土壤中指示菌根真菌和放线菌的PLFA相对含量下降,微生物群落结构发生了变化。Frostergard等用PL-FA方法检测不同重金属污染森林和耕地土壤中微生物数量的变化,发现森林土壤微环境中放线菌生物量增加,耕地土壤微环境中放线菌生物量下降,细菌生物量增加。在有机污染物对土壤的影响研究中,Andersson等通过检测PLFA发现在多环芳烃化合物(PAHs)污染土壤中接种的3个白腐真菌生物量发生变化,表明真菌生物量的增加。1.4土壤微生物多样性BIOLOG方法可以应用与土壤环境中微生物的鉴定和环境微生物群落结构变化的指示。由于BI-OLOG方法是通过对环境微生物对碳源的利用程度来反映环境微生物生理活动的,因此可以更直观地反映微生物生理活动的强度,还能反映出微生物群落结构的生理轮廓以及微生物功能多样性的变化情况。Zhoujuan等在研究中国北方农田土壤不同深度微生物对碳源利用的基础上,指出BIOLOG-Gen方法可以反映出微生物作用的差异性却不能根据脂肪酸和基因片段不同得出微生物类群结构的差异性。滕应等利用BIOLOG方法研究了Pb、Zn、Ag尾矿区土壤微生物活性及其群落多样性,结果显示,随着重金属污染程度的加剧,其土壤微生物群落结构发生了相应变化,尾矿区土壤微生物群落代谢剖面(AWCD)及群落丰富度、多样性指数均显著低于非矿区土壤,表明尾矿区重金属污染引起了土壤微生物群落功能多样性的下降。杨元根、PatersonEandCampbellC用Biolog法对英国阿伯丁市城市土壤和临近农村土壤的微生物群落结构和功能多样性进行研究表明,由于城市土壤中重金属Cu、Zn、Pb的严重积累导致城市土壤与农村土壤相比微生物群落结构和功能多样性发生了变化,微生物活动水平降低,微环境遭到破坏。1.5微生物多样性分析FISH(FluorescenceinsituHybridization)技术是结合了分子生物学技术和显微技术发展起来的用于在环境中监测和鉴定不同的微生物个体,对环境微生物群落进行分析的技术。FISH技术广泛应用于环境微生物学研究和微生物生态学研究中。通过该技术对环境对环境样品(如重金属污染的土壤和有机物污染的土壤)的直接原位杂交,不仅可以测定其样品中不可培养微生物的形态特征及丰度,还可以原位分析它们的空间分布及数量分布。Kobabe等用FISH技术分析了永久冻结层上溶化层土壤中微生物的组成,发现在不同的地平线上细胞量和活性微生物的构成是不同的,从表层到底部的每千克干土壤中细胞数从2.3×109个减少到1.2×108个,这是由于环境条件在垂直分布生态系统中的不同所引起的。FISH技术不仅可以用于分析环境中微生物的空间分布和数量分布还可以动态地跟踪微生物种群的变化。FISH技术在土壤环境中不论是重金属污染还是有机污染物中的具体应用很少有人报道。1.6环境微生物的研究生物信息学是在生物科学、数学、计算机科学的基础上运用计算机科学为手段对生物信息进行收集、加工、整理、分析和解析的科学。生物信息学的发展对人们深入研究自然环境中的微生物群落、结构、功能与动态,研究污染环境中的微生物微生态;研究环境微生物在污染环境中的监测方法以及了解环境、微生物和污染物三者的关系具有重要意义。基因芯片技术是建立在生物信息学基础上发展起来的新技术,该技术在环境污染物的监测和防治方面有着很好的应用。郑永良等认为由于基因芯片技术的高灵敏度、高密度、实时监测、低背景水平等优势被广泛应用于污染环境中有机物降解的研究;刘新星等利用生物信息学把生物冶金使用的常用菌种进行基因比对和分析,去筛选微生物,培育高产、高活性的浸矿菌种。同时,生物信息学还可以对浸矿机理作出新的解释。2土壤微生物多样性分析分子生物技术在矿区土壤微生物研究中的应用,克服了微生物培养的技术限制,并能对样品进行微观地检测和分析。重金属和有机物是矿区土壤污染的主要原因,这两类污染物改变了矿区土壤的微环境,破坏了土壤微生物的生存环境,最终导致矿区土壤质量下降,矿区生态退化。土壤中的微生物多样性的变化直接与土壤环境的变化密切相关,因此,研究土壤微生物多样性的变化用于指示土壤环境的变化具有重要意义。由于分子生物技术可以用于分析微生物的多样性,可以将该技术应用到矿区土壤的生态评价上来,特别是矿区土壤生态恢复评价。PCR技术可以用于检测土壤中微生物基因的多样性;cDNA文库在保存土壤中现有的微生物基因资源情况下,与受污染土壤进行比较发现物种的变化情况;PLFA技术可以对土壤中的优势菌群进行群落结构和功能分析;BIOLOG技术能对土壤微生物群落结构的生理生化轮廓进行准确预测;FISH技术又可以对土壤中不可培养的微生物进行形态分析、空间和数量分析。这些技术都可以用于矿区土壤微生物的多样性检测,可以为矿区生态退化提供一些技术指标。矿区土壤中存在着降解有机污染物的优势菌群,如降解PAH