口腔细菌种群结构及微生物多样性研究进展

口腔细菌种群结构及微生物多样性研究进展

微生物是世界上最常见的生命形式，与人类保持着密切的关系。主要由微生物构成的牙菌斑是口腔常见感染性疾病——龋病和牙周病的始动因子,在口腔中发现的700余个种属或种系型的细菌中,有50%左右未获得培养。菌斑指示剂、传统培养方法及一般的PCR特异性扩增的分子生物学方法,在某种程度上都不能完整反映由大量苛养细菌和未获培养微生物构成的复杂口腔微生物群落。分子生态学及其技术的迅速发展和变革,为微生物群落研究开辟了新的途径,始于三十多年前的rRNA基因分析,帮助研究者绕开培养这一环节,直接对环境微生物进行分析。通过检测和分析从微生物群落中提取的核酸,实现对微生物群落多样性和功能性的研究。原核生物体内普遍存在3种核糖体RNA(ribosomeRNA,rRNA),按沉降系数分为5S、16S、23SrRNA,它们与核糖体大小亚基组合在一起共同参与细菌蛋白质的合成过程。编码rRNA的相应基因为rDNA,在生物进化过程中始终保持相对恒定的生物学功能和碱基序列,同时也存在着与进化过程相一致的突变率,被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺。目前已报道了大约2500个细菌物种的16SrRNA全序列。该基因可分为可变区和保守区,不同的微生物可变区序列不同,可以利用这些特异性序列进行微生物的鉴定;也可通过设计保守区引物,判断细菌的存在与否,并通过共同引物之间扩增产物可变序列的分析,定量测定各种细菌间的种系发生学关系等。近年来,以16SrRNA基因为基础建立的分子生物学技术正逐步广泛用于微生物群落的分析。本文主要介绍基于16srRNA基因的分子分析技术,以及它们在微生物多样性研究中的应用。1序列及序列测定此技术主要包括①基因组DNA的获得:从样本中提取总DNA,或rRNA,因RNA易降解、提取技术复杂,应用相对较少;②16SrRNA基因片段的获得:利用16SrRNA通用引物和PCR技术扩增基因片段;③通过基因片段分析对微生物进行分类鉴定:将目的片段克隆进质粒载体,再转化大肠杆菌,筛选含有目的基因的转化子,最后进行核酸测序。对插入片段的测序具有最高的种系发育分辨力。迅速扩增的序列数据库,使得物种鉴定或者与已知种类的相似度检测得以开展,成为构建种系树以及其他比较研究的基础。此技术已成熟应用于多种生态系的群落研究中。由于序列测定技术的优势,以及高效、高通量设备的使用,克隆的直接测序分析已能得到大力开展。随着自动化程度的逐渐提高,可不需筛选直接进行克隆的测序。克隆测序技术的新发展是获取特定环境中微生物总体基因组信息,称为宏基因组学研究。宏基因组是环境微生物群落的全部遗传组成,包含了比可培养微生物大得多的遗传信息。这种方法是将环境样本的总DNA进行直接分离,构建信息库,扩增16SrRNA基因和功能基因,这项整体测序方法将让我们更深入地了解微生物的多样性,以及群落的代谢和生化潜能。不过,宏基因组的实际应用还受到许多技术和方法的限制,如宏基因组的代表性、信息库的建立和合适的存储及筛选手段等,另外异源表达的相关问题也是限制其成功与否的关键。2dage在口腔微生物分析中的应用变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE),利用序列不同的DNA片段序列在聚丙烯酰胺凝胶中解链条件的不同原理,用梯度变性凝胶分离DNA,相同大小的双链DNA分子由于碱基对组成的不同,解链所需要的变性剂浓度也不同,停留于凝胶的不同位置,借此获得条带图谱。根据细菌16SrRNA基因序列中相差较大的可变区设计特异性引物,扩增出细菌16SrRNA基因的部分序列,通过DGGE进行分离,电泳条带的数目、位置和强度即可反映样品中微生物的种类及相对构成比。温度梯度凝胶电泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)原理与DGGE相似,只是将温度梯度代替了变性剂的浓度梯度。DGGE较易获得DNA序列,且花费较小。但在复杂的微生物群落中,因为核酸片段的协同泳动作用,会造成条带分离不完全。又由于电泳槽的限制,被分析的片段不能大于500bp,若新序列与已知序列的相同性小于85%,则物种分析就存在欠缺。还因为凝胶间有差异、敏感度不够高,其重复性和精确性略显不足。自1993年DGGE被首次用于分析土壤环境中的微生物区系以来,该技术已成为检测环境微生物群落多态性的可靠方法。Fujimoto等和Zjinge等几乎同时将DGGE作为一种新的研究方法应用于口腔微生物的研究,分别检测牙周炎患者龈下菌斑中的病原菌及牙周袋微生物群落组成。Ihalin等在进行伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans)的不同血清型共存的体外实验时,应用DGGE技术并证明其非常有效。3t-rflp技术限制性内切核酸酶,又称限制酶(Restrictionendonuclease),能够特异的结合于一段DNA序列或其附近的特异位点上,并在此切割双链DNA,因此特定的限制性酶谱图可以区分群落中的微生物。该技术是将一对细菌通用引物的其中一条5’末端加以荧光标记,经特定限制酶消化,得到末端限制的DNA片段(TerminalrestrictionDNAfragments,T-RFs),经电泳分析,根据特异片段的数量检测微生物群落的多样性,还可与已知种系序列进行比较鉴定,荧光强度的大小还可确定种的丰富度。近期该技术还发展应用了两种不同的荧光染料标记引物,及应用不同的限制性内切酶分离微生物,这样能使其提高该技术的分类鉴定能力。T-RFLP的敏感度高,可通过数据库模拟结果。但因PCR产物在限制酶消化前需经纯化和脱盐,所以该技术比较费时费钱;其次电脑模拟的T-RFLP片段长度,往往与实验真实结果不完全一致,还可因不完全限制性的酶解作用造成重复性不佳。Sakamoto等将该技术在口腔微生物研究应用中进行了初步探索,使用T-RFLP对18名健康人和18名牙周病患者唾液中存在的口腔微生物进行了分析和对比,研究显示T-RFLP对于口腔微生物多样性的鉴定以及对健康人和牙周病患者微生物群落结构的快速比较有帮助。4pcr扩增法检测16srrna基RISA是研究微生物多样性的较好方法,该序列位于16S和23S核糖体基因间的间隔区(IntergenicSpacerRegion,ISR)。不同种属细菌间的基因间隔序列存在长度和碱基排列的差异,如碱基的插入或缺失,同一菌种不同菌株的ISR也是不同的。因此在菌株的亚分类研究中,ISR对于16SrRNA基因分析起到了很好的补充作用。该方法具有高度敏感性,与DGGE相比,RISA的引物无需GC夹,电泳分析时使用标准琼脂糖凝胶即可。定量FISH试验显示,使用特异性探针得到的ISR,其浓度较16S和23SrRNA更能反映细胞活性。RISA存在两个明显不足:①PCR优先扩增较短的RISA扩增子,会造成偏移;②一个基因组内可存在多重性的ISR。Kumar等应用RISA对数种新发现的慢性牙周病的可疑致病菌进行了种系鉴定。5sscppcr扩增稳定性SSCP是一种广泛应用于基因突变分析的电泳方法,适用于微生物群落分析。类似DGGE/TGGE,SSCP可将相同长度但序列不同的PCR产物进行分离。但与之相反的是,该技术不是基于双链DNA而是单链DNA,单链DNA在凝胶中的电泳动度,不但与长度和分子量大小有关,还与其三维构象相关。当有一个碱基发生改变时,或多或少会使构象发生改变。空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻的程度不同,因此可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。SSCP的敏感度较高,与DGGE/TGGE和T-RFLP相比,无需有GC夹的引物或限制性内切酶。但是单链DNA在电泳时会发生退火,尤其是当DNA浓度很高时,会形成多种稳定构象,从而产生额外条带,若应用5’端带有磷酸化基团的引物,可避免单链DNA的退火以及杂交双链的生成。由于不能预测其迁移速度,故难以估计凝胶中的条带位置。Sabine等应用SSCP对群落的演替和菌种的多样性进行了研究,并与传统的培养方法比较,指出PCR-SSCP法避免了传统培养的人力物力消耗以及误差干扰,适于微生物群落结构和演替的研究分析。Tomoyuki等以SSCP和DGGE对细菌或古菌的16SrRNA基因片段进行了对比研究,发现细菌的SSCP条带很清晰,能比DGGE更好地区分细菌群落内的不同构成,但对于古菌两者的结果相同。6生物流体的性质荧光原位杂交是以荧光标记取代同位素标记的一种原位杂交方法,荧光标记的寡核苷酸探针能特异地与互补核酸序列在完整的细胞内结合,通过检测激发荧光信号,完成特异微生物的鉴定和定量分析。激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)也已被用来研究完整的生物膜,与FISH的结合可提高对微生物群体的空间关系以及变化情况的分析能力。FISH还常与酶谱法的一种(大多为DGGE或T-RFLP)或克隆/测序法联用。与酶谱法不同的是,FISH可能在技术层面受到荧光淬灭和探针特异性的限制。尽管如此,通过分析阳性细胞内荧光的强度,从而检测其代谢活动水平,在这一点上,FISH还是很有吸引力的。Dige等运用16SrRNA-定向的寡核苷酸探针鉴别链球菌等细菌,描述了早期牙菌斑的结构,并对CLSM与FISH在这方面的联合使用作出了评估。Al-Ahmad等使用多通道FISH和CLSM对牙菌斑的形成和结构进行了量化研究,认为多通道FISH适用于牙菌斑中四种重要组成细菌的动力学研究。7pcr扩增检测实时定量PCR技术自1996年诞生以来,不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域,而且还作为定量分析方法应用于微生物生态学研究。常规PCR技术是对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析,实时定量PCR是在扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量。它的定量原理是基于DNATaq酶有5’→3’外切酶活性以及荧光能量传递技术(Fluorescenceresonanceenergytransfer,FERT),构建了双标记寡核苷酸探针,即TaqMan探针。继TaqMan探针之后相继出现了分子信标、Amplisensor和杂交探针,最近又出现了与双链DNA非特异性结合的染料,如SYBRGreenI。该技术操作简便、快速高效、高通量,而且具有很高的敏感性、重复性和特异性。由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,不需电泳和紫外、染色观察,杜绝了常规PCR扩增产物的污染,确保了检测的准确性。还可通过设计不同的引物在同一反应体系中进行多个靶基因分子扩增。Lyons等应用定量实时PCR对牙菌斑内的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivosa)以及细菌总量进行了定量分析,并证明了该方法的敏感性和可靠性。另外有长度异质性PCR(LengthheterogeneityPCR,LH-PCR)、稳定同位素探测(Stableisotopeprobing,SIP)和荧光原位杂交-显微放射自显影术(Fluorescenceinsituhybridization-microautoradiography,FISH-MAR)等新技术可以应用于微生物群落结构分析。但由于这些方法需要相对昂贵的设备,在口腔微生