单基因遗传病的基因治疗

单基因遗传病的基因治疗

自20世纪90年代美国f.a批准设立第一项人类基因治疗临床试验方案以来，基因治疗的研究已经经历了10多年。这项研究的快速发展导致了较小的水平，也不能成为传统治疗的手段。目前已有少数有确切疗效的临床试验,现报告如下。一、参加临床试验的基本信息截至2001年2月发表文献的数据统计,目前开展的临床试验方案已达532项,其中恶性肿瘤331项,单基因遗传性疾病71项,感染性疾病36项,心血管类疾病36项,其他类疾病8项,基因标记48项,健康自愿者的安全试验2项。参加临床试验的总人数达3436人。所用的载体系统主要有病毒载体系统和非病毒载体系统,前者包括逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、腺相关病毒和单纯疱疹病毒;后者主要有脂质体、裸DNA以及基因枪等。参加的国家包括我国在内已有21个国家。在开展的临床试验方案中,Ⅰ期为359项,Ⅰ~Ⅱ期为111项,Ⅱ期为57项,另外有5项已进入Ⅱ~Ⅲ期临床试验。二、临床试验现状1.逆转录载体在mtfg从1990年第1例SCID-ADA基因治疗方案至今,已有18种单基因遗传病开展了基因治疗临床试验。主要为肺囊性纤维化、戈歇病、血友病、a-抗胰酶缺失和严重联合免疫缺陷症(SCID-ADA、SCID-X)等。Marina等进行了SCID-X的Ⅱ期临床试验,通过体外逆转录病毒介导细胞因子γC受体基因转导患者造血干细胞,然后回输,结果从T、B、NK淋巴细胞的数量、功能以及抗原特异性反应方面均达到了与正常人相当的程度,且患者已能正常生活。与第1项SCID-ADA基因治疗临床试验方案相比,Marina等的结果更为成功。这是因为:(1)该方案中利用了高表达的逆转录病毒载体MFG;(2)选择了CD34+的造血干细胞作为靶细胞;(3)在靶细胞的体外培养中加入了能够促进造血干细胞增殖的IL-3以及flt3-L细胞因子。这也说明基因治疗经过10年的努力已取得了很大的进步。单基因遗传病基因治疗的关键是外源基因能在体内长期稳定的表达。因此,选择合适的转移载体以及合适的靶细胞十分关键。腺病毒具有强的免疫原性,且其介导的外源基因不能整合,可能难以达到长期稳定表达的要求。虽然Marina等成功地运用了逆转录病毒载体,但由于其滴度及转导效率较低只适于体外转导,因而需要进一步改进。研究人员认为,免疫原性低、可感染多种分裂相和非分裂相细胞、能够整合且适于体内转导的腺相关病毒和慢病毒,可能是治疗单基因遗传病的理想载体。2.逆转录载体诱导的期临床试验研究在恶性肿瘤的临床试验方案中,至少有9种不同的方法,最多的是免疫基因治疗,其次是自杀基因和肿瘤抑制基因治疗。已有一种通过脂质体介导HLA-B7/Beta2微球蛋白基因治疗黑色素瘤的方案已进入Ⅲ期临床试验。但肿瘤细胞本身也存在逃避免疫系统识别和攻击的机制,因此,仅靠自身免疫系统对肿瘤的直接杀伤是有限的。自杀基因通过将前药转变为对细胞有毒害的药物造成对肿瘤细胞的直接杀伤,并有一定的旁杀效应,从而降低肿瘤的负荷。据48个单位组成的国际研究组开展的一种Ⅲ期临床试验报道,用逆转录病毒载体介导自杀基因HSV-TK/GCV,对248例初治多形脑胶质瘤进行临床试验的研究。结果表明,无扩展中位生存期和总中位生存期,且与对照组差异无显著性。原因主要是逆转录病毒载体体内转导效率太低,另外前药如何能顺利透过血脑屏障也是需要解决的问题。但患者大多数能够耐受,且无明显不良反应。在肿瘤抑制基因治疗中用的最多的是p53基因。目前已有一种用腺病毒载体介导p53基因治疗头颈鳞癌的方案进入Ⅲ临床试验阶段。除以上3种方法外,进入临床试验的方法还有反义、化疗保护、单链抗体、癌基因下调以及载体介导的肿瘤细胞裂解等。腺病毒载体介导的肿瘤细胞裂解的一项Ⅱ期临床试验,已显示了明显的治疗效果。进一步提高基因的体内转导效率是提高肿瘤基因治疗效果的关键。由于肿瘤是复杂的多基因疾病,仅依靠某一种基因治疗方法似难于奏效,多种方法进行有效联合,可产生优势互补,并可能产生抗肿瘤的协同效应。另外,在当前一段时间内,基因治疗可能还应与常规的治疗手段,如放疗、化疗及手术进行联合,以取得更为明显的效果,发挥出基因治疗的优势,体现其临床上的应用价值。3.防止血栓形成目前心血管疾病基因治疗主要包括:促进心肌及下肢缺血的血管形成,防止急发性狭窄及血管成型术或血管移植后的再狭窄,用于血管的修复和吻合,防止血栓的形成。在临床试验中,通过转移内皮细胞生长因子(VEGF)及成纤维细胞生长因子(FGF)基因的治疗,已在下肢和心肌缺血中促进了血管的生成和血液的流通。另外,在冠状动脉狭窄及血管移植后再狭窄的动物模型中,通过转移VEGF、一氧化氮合酶、TK、Rb、金属蛋白酶组织因子、FasL等应用,均取得了有前景的效果。4.hiv的感染目前感染性疾病的基因治疗主要是集中在AIDS,个别为治疗EBV和CMV感染。利用DNA疫苗防治HIV的感染已进入Ⅱ期临床试验阶段。已有近400例AIDS患者接受Ⅰ期临床试验,结果表明是安全可行的,如能高效地转导和回输更多的靶细胞,治疗效果将会更为明显。三、疾病认识的问题目前基因治疗体系还存在许多基础性的问题。这些问题针对不同的疾病有所不同,普遍的问题仍然是载体方面,而对疾病的深入认识以及探索新的思路也是重要的问题。1.非病毒载体系统腺病毒载体滴度高、转导效率高、且可感染多种分裂和非分裂相的细胞,因此适用于体内转导。腺病毒载体存在的主要问题是免疫原性较强。如何降低其免疫原性,策略主要有:(1)剔除更多乃至全部(无内脏载体)的病毒结构基因;(2)阻断免疫激活的共刺激信号;(3)加用免疫抑制剂。另一个方向是改造腺病毒外膜蛋白纤维,以进一步提高其转导的效率和靶向性。逆转录病毒载体具有较低的免疫原性,并能整合,且外源基因的表达时间较长。其主要缺点是滴度低、体内转导效率低、且不能转导非分裂相细胞,只适用于体外转导。利用口炎病毒的外膜蛋白VSV-G基因替代MMLV的外膜蛋白后,可耐受超离浓缩,以提高病毒的滴度。利用免疫缺陷病毒,如HIV来源的核心元件与双嗜性病毒外膜蛋白构成的嵌合载体,可感染多种非分裂相细胞,可用于直接体内转导。通过对逆转录病毒载体LTR区进行改造,或在载体中插入核骨架基质结合区(S/MAR),在一定程度上可阻止外源基因被关闭(Silencing)。腺相关病毒载体(AAV)既具有逆转录病毒整合的特点,又具有腺病毒转染多种非分裂相细胞的特征,是长期表达外源基因较理想的载体。AAV存在的主要问题是制作过程较复杂,纯化较难,易有辅助病毒的污染,且包装容量有限。通过利用质粒代替辅助腺病毒,提供反式包装元件,可防止辅助病毒的产生,但会降低AAV的生产效率。非病毒载体系统主要有阳离子脂质体、裸DNA、DNA聚合体、基因枪、电脉冲转移。非病毒载体系统免疫原性较低,安全可靠,并适于大规模生产,在需要外源基因短暂表达的方案中具有其优势,并广泛应用于各种DNA疫苗的研制中。非病毒载体缺点是体内转导效率低,靶向性差,基因表达时间短。目前主要是进一步优化非病毒载体的转导条件,提高其转染效率,并与病毒载体相结合,从而延长基因的表达时间。非病毒载体转运的DNA中,非甲基化的CpG常常会引起强烈免疫反应,从而引起炎症反应以及造成转移基因的丢失,这一点近来才受到重视。通过减少CpG或将CpG甲基化,以降低其免疫原性;另外,使用免疫抑制剂也是常用的策略。目前还未有理想的载体能全面满足基因治疗的需要,今后还应继续加强载体的研究。应根据不同疾病的特点及不同治疗的需要,对载体的选择应有所不同,从而使不同的载体发挥其不同的优势。2.疾病发病机理在加强对载体开发和改造的同时,还应进一步加强对疾病的认识。已获得初步疗效的临床试验均对疾病发病机理比较明确,转移靶基因确定,如血友病B、SCID-X、下肢缺血和p53缺陷的肿瘤等。因此,进一步加深对疾病发病机理的认识,加强病毒与细胞相互作用的深入了解,以找到攻击疾病的中心靶点,发现更为有效的治疗基因和开发更为理想的基因转运载体。3.细胞生物学在其他方面基因治疗中的应用和完善基因治疗应用最多的载体是病毒载体,且均为无复制能力的病毒载体。但目前尤其在肿瘤的基因治疗中,再高的病毒滴度可能也无法满足转导全部肿瘤细胞的要求。在此情况下,具有复制能力的病毒载体能使基因在体内从一维形式的转导变为多维形式的转导,从而大大提高了基因转导的效率,并从理论上有可能转导全部的肿瘤细胞,应是今后肿瘤基因治疗研究的方向之一。当然,如何通过内源和外源途径严密控制病毒载体的复制是应着重研究的问题,另外,由病毒的复制所带来的安全性问题也是不容忽视。同样,目前遗传性疾病的基因治疗主要是采用基于正常基因cDNA的增补(supplement)疗法,这种策略必然要面临着转移基因的靶向性、表达的调控性以及载体的安全性等问题。随着研究的不断深入,利用小分子的寡核苷酸将基因的突变位点进行定向修复(targetedrepair)已成为可能。基因在原位得以修复的策略,使基因的表达依然受内源调控元件的调控,与传统的辅助基因治疗的策略相比将是根本性的转变。有研究表明,利用RNA/DNA嵌合寡核苷酸可有效定点修复基因的点突变,体内平均效率可达20%左右