抗生素的细胞药代动力学研究

抗生素的细胞药代动力学研究

一些病毒可以存在于真核细胞中，并在繁殖。它不仅可以避免寄生虫的液体免疫，还可以避免抗生素的作用。这种细胞疾病也导致反复感染和持续性疾病。抗生素在胞内的抗菌活性往往很差,导致病原菌的耐药突变株很容易形成。因此,迫切需要解决如下几个问题:(1)抗生素在胞内的抗菌效果究竟如何;(2)抗生素的胞内活性跟哪些药代动力学参数相关;(3)如何提高抗生素在胞内的活性。传统的药物代谢动力学并不能完全解释药物在一些特定组织中的药理学作用,如肿瘤、脑组织等。有些药物并不能在靶细胞中富集,导致了药效的降低。因此血浆中抗生素的浓度往往并不能反映药物在细胞内的抗菌作用。抗生素必须先通过细胞膜,与细胞内的靶病原菌结合,然后才能发挥其胞内抗菌作用,抗生素在细胞内的蓄积和分布是决定抗生素在细胞内抗菌活性的重要参数。因此,基于血浆浓度的抗生素经典药动学研究不足以有效地预测抗生素体内药效,开展抗生素的细胞药代动力学研究势在必行。本综述旨在将抗生素的胞内药代动力学参数与其胞内抗菌活性结合起来,总结影响抗生素胞内活性的PK/PD参数,并且探讨优化其胞内活性的策略。1胞外-溶酶体/一性离子型病原菌的感染途径抗生素必须先与细胞内的靶病原菌结合才能发挥其作用,因此,了解病原菌在细胞内寄生的具体定位是非常关键的。研究者发现,除了一些专门寄生于细胞内的微生物,一些常见的病原菌在某些特定条件下也会在胞内生存。病原菌进入细胞后会采取多种方式来逃避细胞正常的“胞外-溶酶体/吞噬空泡”吞噬程序。表1总结了一些胞内专有型及条件型病原体侵染的靶细胞及其胞内定位。几乎所有的致病菌在侵入细胞后都首先进入有膜包被的吞噬空泡中,随后发生如下变化:有些病原菌在内吞后不久即可以逃离吞噬体内的酸化和隔离,避免传统的胞吞降解路线,最终到达pH中性并且富营养的细胞质,如利斯特菌、志贺菌和立克次体;有些病原菌停留在吞噬体中,并与新形成的内含体融合,如分枝杆菌;有些病原菌虽然仍停留在吞噬体中,但无法与其他空泡融合,如布鲁氏菌、沙门氏菌和弗朗西斯菌;衣原体也停留在吞噬体中,并且转换成为特异实体;在某些情况下,含有病原菌的吞噬体会以异常的自吞形式与内质网融合,如军团菌;还有一些菌可以抵抗吞噬体与溶酶体融合,并且在吞噬空泡中繁殖,如金黄色葡萄球菌和柯克斯菌。2细胞药代动力学经典药代动力学关注药物在血浆和组织水平的吸收、分布、代谢和排泄,而细胞药代动力学着眼于药物在单个细胞上的渗透、分布、降解和外排。这两方面是紧密结合的,因为药物在细胞内的处置往往决定了其在整个机体内的药动学命运。表2列举了常见抗生素的细胞药动学特性。2.1酰胺类抗生素的药代动力学β-内酰胺类主要是通过被动扩散进入细胞内,平衡时药物的胞内/胞外比不超过1。大多数β-内酰胺类抗生素呈弱酸性,这一类物质在弱酸性的有膜隔室中的蓄积量往往小于碱性和中性隔室,因此β-内酰胺类抗生素虽然有穿透生物膜的能力,但很难在与胞外相比偏酸性的细胞内蓄积,尤其是溶酶体和酸性空泡这类低pH、病原菌易蓄积的隔室。β-内酰胺类的肠道吸收是通过一些小肽的转运体如PEPT1,或单羧酸化合物的转运体如MCT1,而肾小管细胞的重吸收是通过肽转运体PEPT2和有机离子转运体如OCTN2。然而这些转运体对不同的β-内酰胺类的识别差异很大,这就解释了为什么不同的β-内酰胺类抗生素的口服生物利用度和清除率会有很大差异。氨基糖苷类药物是一类含多氨基的大极性分子,与膜上的酸性磷脂或内吞受体兆蛋白(megalin)结合,通过吸附内吞及受体介导内吞的两种途径进入细胞内。氨基糖苷类药物进入到胞内的速度非常缓慢,然而有些细胞,如肾近端小管和内耳毛发细胞,megalin的表达非常高,因此,氨基糖苷类药物在这类细胞上的蓄积非常广泛与迅速。与β-内酰胺类和氨基糖苷类药物相反,大环内酯类药物在几乎所有细胞中都呈现高蓄积量。基于他们的弱碱性特征,大环内酯类药物大多以带正电荷、低渗透的形式蓄积于溶酶体中。不同大环内酯类衍生物之间的蓄积程度差异也较大。红霉素及单碱基大环内酯的蓄积量相对较低,而二元碱基的药物,如阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等蓄积量明显增大。溶酶体内pH约为5,不超过细胞总体积的5%～10%,因此溶酶体内的药物浓度可达到胞外的100倍,而对于二元碱基的药物来说,甚至能达到10000倍。喹诺酮类可以通过简单被动扩散进入细胞,但是达到平衡时胞内浓度一般要高于胞外浓度。喹诺酮类可以扩散到各个细胞器,且无靶向结合。药物进入细胞的速度非常快,但是究其机制目前并没有很令人信服的解释。有研究发现,喹诺酮类可通过嘌呤类及氨基酸类的内向转运体进入到细胞内。然而,喹诺酮类从胞内流出的速度也很快,使其不能在胞内长久维持有效浓度,这也限制了它治疗胞内感染的能力。对其他类抗生素胞内分布的研究尚不多见。林可霉素类的克林霉素在胞内蓄积量较大,这是因为它呈碱性,且核苷转运体很可能参与了其内向转运;然而,和它非常类似的同源物林可霉素在胞内的蓄积量却很小。少量的研究证明四环素可以进入细胞,但其机制还不明确。糖肽类抗生素是大分子,也是通过内吞作用进入细胞,但不同的糖肽类在细胞内的蓄积量相差较大:两性的糖肽类分子,如替考拉宁、特拉维酸和奥利万星,比亲水性的万古霉素在细胞内的蓄积量都大很多,其中奥利万星在胞内的浓度更是能达到胞外的几百倍。2.2其他转运体真核细胞上跨膜转运体对药物的主动外排是决定抗生素药动学行为的一个重要因素。外排转运体通常参与胞内的内源性及外源性分子的排出,这些转运体有广泛的底物特异性。其中,ATP结合盒耐药蛋白(ABC)的作用最为常见,包括P-gp、MRP和BCRP,而其他转运体一般有特异性分布,如有机阴离子、阳离子转运体通常在上皮细胞中发现。这些转运体对药物引起的细胞凋亡也起到了抵抗作用,对于抗生素来说,氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类及氯霉素类都有可能促进细胞凋亡。这些转运体的存在会加速抗生素从胞内流出,保护了细胞但同时也降低了胞内药效。Marquez等发现MRP4介导了环丙沙星在鼠J774巨噬细胞上的外排,然而长期药物诱导发现MRP4和MRP2都有一定程度的上调;Lemaire等发现环脂肽类抗生素达托霉素在人THP-1巨噬细胞和MDCK细胞上都有P-gp介导的外排,从而降低了其对吞噬进胞内的金黄色葡萄球菌的杀灭作用。3药物及病原菌感染的比较大量的抗生素不能有效地渗透到细胞内,因此造成了较低的细胞内浓度,如β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素。然而,很多研究表明,抗生素的胞内药效与其蓄积量并不呈简单的相关性。尽管许多抗生素的胞内浓度已经远远超过了敏感菌株的MIC,它们在胞内的杀菌效果却不尽如意。原因可能有:(1)抗生素在细胞中的低生物利用度。部分进入细胞的药物可能与细胞内成分相结合,如氨基糖苷类、大环内酯类以及奥利万星,易与细胞膜上的脂质相结合,甚至会导致溶酶体内的脂质沉积。(2)抗生素及病原菌在细胞内的分布不同。如奥利万星在细胞内的蓄积量非常大,但对胞内的利斯特菌几乎没有作用,而对金黄色葡萄球菌却非常有效,这很可能是因为奥利万星和金黄色葡萄球菌都定位于溶酶体,而利斯特菌定位于细胞质。(3)细胞内环境因素不利于药物活性的发挥,而且会影响病原菌对药物的应答。如氨基糖苷类主要蓄积在溶酶体中,而溶酶体等酸性隔室不利于药物活性的发挥;有些菌如金黄色葡萄球菌能在酸性隔室中存活,在此环境中其对抗生素的敏感性会降低。(4)许多药物是作用于病原菌的快速繁殖期,而病原菌在刚刚进入细胞内后,往往会增殖缓慢,休整以适应新的环境,因此这类抗生素的胞内杀菌能力会大大降低。由于喹诺酮类、大环内酯类、林可霉素类和利福霉素类在细胞内的浓度都高于血浆浓度,治疗胞内感染一般首选这些药物。氨基糖苷类只有在长时间作用时才能进入细胞,因此一般治疗如肺结核这样的慢性胞内感染。尽管β-内酰胺类并不在胞内大量蓄积,但是其在血浆中的浓度非常高(峰值>50mg/L),以致其胞内的浓度超过了多种菌的MIC。因此,β-内酰胺类高浓度、长时间的作用仍对胞内菌有效。4细菌细胞内抗菌活性近年来,已有报道多种体内外模型应用于抗生素胞内抗菌活性的评价。如Tano等首次提出了一种动态体外模型,通过不断变化细胞培养基中的药物浓度来模拟抗生素在人体内的药动学特征,在此基础上研究抗生素的胞内活性。体内模型的研究相对较少,Sandberg等提出了一种用小鼠腹膜炎模型来作为研究抗生素对胞内金黄色葡萄球菌活性的体内模型。体内模型提出了一个“整体”的概念,包括机体免疫系统、整体药物动力学和动态的胞内感染过程。但是这种模型难以进行标准化,也更难区分抗生素的实际作用与体内其他影响。近年来也出现了许多准确、快速检测胞内菌的方法,如Qazi等将GFP-luxABCD报告操纵子转染到金黄色葡萄球菌中,然后通过荧光强度来实时监测胞内活菌数;Roch等用RT-PCR快速将胞内菌定量。然而,目前针对胞内菌的细胞药代动力学研究并不多见,尚局限于胞内蓄积量的测定,但胞内蓄积量并不能完全预测药物在胞内的抗菌活性。药物在细胞内的处置是个非常复杂的过程,这促使我们必须建立一种抗生素的细胞药代动力学模型,包括分析抗生素在细胞上的渗透与外排速率、胞内蓄积量、亚细胞分布与靶向结合,进行主动转运体的鉴定及胞内代谢鉴定等,并与药物活性进行相关性分析,建立PK-PD结合模型,预测和评价抗生素的作用及其细胞内药代动力学机制。5胞内感染的治疗面临着更大挑战针对胞内感染的药物需要进入细胞、达到治疗量水平并维持足够的时间;同时,多药耐药现象的产生及不断增加使胞内感染的治疗面临着更大的挑战。很多因素影响抗生素在胞内的药动学行为进而影响其抗菌活性,针对这些因素,研究者们探索了一系列优化措施,其中最为深入与广泛的研究是增大药物胞内浓度和延长胞内作用时间。5.1抗过血药的前药明确规定其进入细胞对于像β-内酰胺这类不容易在胞内大量蓄积的药物,合适的化学修饰可以优化它们的细胞药动学参数,使它们能更多地被细胞摄取。β-内酰胺类的弱酸性特征阻碍其进入细胞,通过设计电中性的前药可以解决这一问题。如氨苄西林的弱碱性酯化衍生物匹氨西林可以作为前药大量进入细胞,细胞内的酸性环境会促进其酯键裂解生成有抗菌活性的氨苄西林,从而使其杀灭胞内利斯特菌的能力大大增强;已在部分国家上市的新一代β-内酰胺类抗生素头孢吡普酯亦是基于此机理的前药。新型喹诺酮类抗生素Finafloxacin于C-8位引入一个氰基,在弱酸性条件下显示出卓越的抗菌活性,且在THP-1细胞内蓄积量增加,有望应用于胞内感染的治疗。5.2生物及其产物设计有效的载药系统使吞噬细胞有效的内吞、并在胞内释放药物是目前治疗胞内感染的一个主要研究方向。这种载药系统包括脂质体、多聚体和纳米粒,可以针对胞内感染靶向给药,提高药物在胞内的治疗指数,从而避免过高的整体给药剂量带来的副作用,增强患者的耐受性,同时也使包含的药物免受早期免疫和酶的作用。脂质体主要通过内吞作用进入胞内,最终通常会进入溶酶体中,因此对积聚在溶酶体里的病原菌活性较好,如将万古霉素包被于一种脂质体中能显著提高其在胞内浓度及对胞内MRSA的杀灭能力。相反,这种方式对于寄生在其他细胞器里的病原菌的疗效会降低。有种pH敏感的脂质体可解决这一问题:它在中性pH下稳定,而进入显弱酸性的细胞质后就会分解并释放内含的药物,然而其储存与给药后的稳定性差成为制约其发展的一个主要因素。人工合成的生物可降解多聚体微粒及纳米粒显示出更好的特性,在稳定性好的同时,能将包含的药物可控速释放。Seleem等将链霉素和多西环素同时包被于多聚纳米粒中,与游离药物联用相比,能显著降低胞内的布鲁氏菌。Maya等用O-CMC载四环素能将其杀灭胞内菌的药效提高6倍。另外,近期研究表明,某些多聚体药物载体可以通过诱导巨噬细胞的激活状态产生抗菌协同作用。因此,在确认其体内安全性后,这种载有抗生素的多聚体微粒及纳米粒将有望在人体中应用。5.3环丙沙星对大鼠k-沙星的影响有些抗生素会被细胞主动外排,因此,有人推测抑制相应的外排转运体会增加药物的胞内含量,从而增强药物的胞内活性。Seral等证实P-gp抑制剂维拉帕米能增强阿奇霉素对鼠J774细胞内的利斯特菌和金黄色葡萄球菌的杀灭作用,而MRP及OAT的抑制剂吉非贝齐能使环丙沙星杀灭胞内利斯特菌增效2.5倍,但对胞内金葡菌没有增效作用。因此,如果细胞内增加的药物所在隔室与病原菌所在的隔室相同,使用外排转运体抑制剂将是一种增强抗生素胞内活性的有效手段。6胞内感染前药物的优化尽管大量新的抗生素层出不穷,胞内