肿瘤研究方法课件

肿瘤研究方法肿瘤研究方法1（优选）肿瘤研究方法（优选）肿瘤研究方法2

体外研究(InVitro)

原代培养肿瘤细胞:从肿瘤组织中分离得到的细胞在体外成功地进行培养称为原代培养(primaryculture)肿瘤细胞系:原代培养肿瘤细胞能连续传代（约7～10天传代一次）半年以上,生长稳定,并能保持肿瘤细胞的特性，称为肿瘤细胞系(cellline)肿瘤细胞株:细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株(cellstrain),细胞具有相同的基因型和表型(单克隆)体外研究(In3肿瘤细胞株的建立：

1、直接从人的肿瘤或动物的自发及诱发肿瘤组织分离培养建系和建株;(从自发或诱发瘤)2、从人或动物的移植肿瘤(如人肿瘤裸鼠移植瘤)组织分离培养建系及建株;(从移植瘤)

3、用化学或生物(病毒)方法在体外转化正常的人或动物的细胞株而获得肿瘤细胞株。(体外转化)肿瘤细胞株的建立：4肿瘤细胞株的鉴定：

1.

有关的原始资料,包括供瘤病人的姓名、年龄、性别、病历号、临床诊断（TNM）、活检病理诊断,手术切除日期、最后病理诊断等

2.形态学观察:▲普通倒置相差光镜:活细胞的形态,细胞间桥,分泌颗粒,重叠生长,

▲Giemsa染色或H.E.染色的光镜

形态与肿瘤细胞的生长条件有一定关系:

HeLa:高浓度血清→长梭形;

低浓度血清→圆形细胞,排列如鹅卵石路面;

▲透射和扫描电镜

▲3D组织结构肿瘤细胞株的鉴定：5

3.

核型及染色体观察:

整倍体,异倍体,染色体畸变、标记染色体,染色体分带分析,

相隔一定时间重复观察数次

4.生长特性:

分裂指数（[3H]-thymidine或5-BrdU的labelingindex）、生长曲线、细胞群体倍增时间、集落形成或贴壁率（platingefficiency）半固体培养介质中的集落形成率

5.组织特性的鉴定:

免疫细胞化学方法

6上皮性肿瘤标志:CK、上皮膜抗原（EMA）、癌胚抗原（CEA）;

淋巴瘤抗原标志:人白细胞分化抗原簇（CD）,有274个以上,T淋巴细胞:UCHL-1(CD45RO),B淋巴细胞:L26（CD20）,

软组织肿瘤标志：波形蛋白（Vm）肌源性：结蛋白（Dm）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白神经源性：神经微丝（NF）、S-100蛋白、Leu-7、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、髓磷脂碱性蛋白(MBP)

组织细胞源性：α-1抗胰蛋白酶、α-1抗糜蛋白酶、CD68

血管源性：八因子相关抗原、CD34、荆豆凝集素(UL)

基膜源性：纤连蛋白（FN）和层粘连蛋白（LN）体外培养时肿瘤细胞株有可能会失去原本表达的某些组织抗原,抗原标志要多选用几种抗体,以减少假阴性结果;上皮性肿瘤标志:CK、上皮膜抗原（EMA）、癌胚抗原（7

6.

其他特性：

(a)分泌激素和异位激素:

绒毛膜癌→HCG

垂体瘤→生长激素肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌→ACTH

人肺巨细胞癌细胞株（PLA-801）→促性腺激素肝癌→HCG(b)

肿瘤细胞的受体表达:ERPRAR(c)

酶及同工酶活性:

酶活性保持(HTC→酪氨酸氨基转移酶)、变化诱导剂糖皮质激素、多肽激素改变培养条件：谷氨酸替代谷氨酰胺→脑星形胶质细胞谷氨酰合成酶活性增7倍左右特异的同工酶谱：绒癌T3M-3表达胎盘性碱性磷酸酶

8

(d)

癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达：

高转移人卵巢细胞系HO-8910PM

表达：p53p16bcl-2nm-23CD44v6c-erbB-2EGFR等基因的蛋白产物不表达：Bax基因的蛋白产物

9

7.细胞株交叉污染的检测：细胞遗传学方法：染色体分析特异的染色体标志探针作FISHG带核型分析鉴别同种肿瘤细胞

Q带分析检测人Y染色体

免疫学方法：HLA或动物的组织相容性抗原的测定

生化方法：同工酶谱或其它生化指标7.细胞株交叉污染的检测：10SSCP↓55℃,3-5h模板间竞争减少，有利于低丰度mRNA扩增*平均寿命仅14～30d。被测样品只需数mg甚至不到1mg的DNA人肺小细胞癌细胞株LU-165→抗利尿激素;肝癌→HCG首推黄曲霉毒素(aflatoxin),存在于霉变的花生、消化：180mlpH8.人肝癌高转移裸鼠模型,定名为LCI-D-20经PCR-SSCP确定DNA片段有突变，该片段经测序可确定突变的形式和定位，可避免因测序或PCR反应出现的碱基配对差错造成的假阳性人黑色素瘤细胞株MV3、基化→基因低甲基化（可传代）*胸腺依赖性T细胞明显减少或缺乏,+25ml1%xylenecyanol（1）先通过消减杂交使差异片刻富集

8.微生物污染的检测：

细菌：培液混浊，高倍镜下隐约可见均匀散在细小菌体

真菌：培液混浊，高倍镜下可见菌丝或孢子病毒：病毒核酸和蛋白产物支原体：以核酸（DNA）荧光染色即H-stain(Hoechst33258，即二苯并咪唑染色)较为常用,356nm光的激发下可发出458nm的强荧光,

SSCP11体外正常细胞恶性转化的鉴定

正常细胞体外恶性转化的鉴定指标(14项指标)

（第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过）

▲核型分析出现非整倍体

▲能在软琼脂培养基中增殖并形成集落

▲异种动物接种能生成肿瘤

▲端粒保持不变或延长以及端粒酶活性的增高

肿瘤研究方法课件12

指标正常细胞转化的纤维母细胞转化的上皮细胞

形态

伸展良好,折光较弱;核质比小,梭形,伸展较差,折光较强;核质比大,与正常细胞之间差别不如纤维母细胞胞质嗜碱性弱;核仁较小较少;胞质嗜碱性强,核仁较大较多;多核巨细胞大;多形性较常见

多核巨细胞较少较多

粘附性细胞间粘附性较强,紧贴瓶壁生长粘附性差,易脱落差别不明显生长特性排列有方向性,单层生长,存在密度方向性消失,多层重叠,密度依赖性抑制消失

差别不明显,某些细胞株呈重叠生长依赖性抑制

对血清的依赖较高较低差别不明显

扫描电镜观察微绒毛少微绒毛丰富微绒毛不稳定,有时增多植物凝集素引起的凝集

弱较弱较强

细胞表面的糖蛋白和糖脂

正常糖基化不完全糖基化不完全

纤维连接蛋白正常存在减少或消失

纤溶酶原激活酶较低增高不稳定,某些株增高

胞质中微丝微管的排列

规则紊乱不稳定

胞质cAMP浓度较高较低

核型二倍体非整倍体或假二倍体非整倍体

琼脂培养不生长生长生长

接种异种易感动物不长肿瘤长肿瘤长肿瘤

指标正常细胞13

世界各国的细胞库（cellbank）及索引

美国

美国典型培养细胞库（AmericanTypeCultureCollection,即ATCC,Rockville,MD）人与动物细胞培养目录（CatalogofHumanandOtherAnimalCellCultures,NavalBiosciencesLaboratory,CellCultureDepartment,NavalSupplyCenter,Oakland,CA)

人基因突变细胞及老年细胞培养库（HumanGeneticMutantCellCultureandAgeingCell,CultureRepositories,InstituteforMedicalResearch,Camden,NJ)

欧洲真核细胞培养库(CulturedeCellulesEucaryotes,RepertoiredesUtilisateurs.,M.Adophe,D.Gourdji,A.Tixier-Vidal,R.Robineaux,InsermPublications,101RuedeTobiac,75654Paris,Cedex13医学病毒学系（DepartmentofMedicalVirology,InstitutedePasteur,Paris)

欧洲动物细胞培养库（EuropeanCollectionforAnimalCellCultures,即ECACC,PHLS/CAMR,Porton,Salisbury,England)

欧洲人类基因突变细胞库(EuropeanHumanGeneticMutantCellBank,DepartmentofClinicalGenetics,ErasmusUniversity,Rotterdam)

日本癌细胞系库(CollectionofCancerCelllines,National

InstituteofHygenicSciences,Tokyo)

普通细胞库(GeneralCellBank,InstituteofPhysicalandChemicalResearchofRIKEN,Saitama)

FlowLaboratories;GIBCO

14特殊表型肿瘤细胞系（株）：高转移人肝细胞性肝癌细胞株MHCC97

人黑色素瘤细胞株MV3、卵巢癌细胞株HO-8910PM、肺巨细胞癌细胞株PGBE1

高度耐药人红白血病细胞株K562/ADM对阿霉素的抗性增114.7倍分泌产生激素、蛋白、酶或一些因子人肺小细胞癌细胞株LU-165→抗利尿激素;

人肺腺癌细胞株LC-2/ad→α1-抗胰蛋白酶人红白血病细胞株K562高表达端粒酶肿瘤研究方法课件15

体内研究(InVivo)

肿瘤动物模型：自发性肿瘤诱发性肿瘤移植性肿瘤.

16年龄:一般而言,动物年龄越小,对化学致癌物越敏感,特异的染色体标志探针作FISH1)人肺癌高转移裸小鼠模型在3′端多2个碱基，使与之匹配的模板减少，无胸腺大鼠诱发鼻咽癌↓55℃,1h水相+25mlNaOAc3M,1mlglycogen,750mlEtOH(pure)→正常细胞的癌变.Microsatellitesanalysis分裂指数（[3H]-thymidine或5-BrdU的labelingindex）、巴豆油A因子（TPA）为促癌剂乳头状增生、不典型增生PCR产物run非变性PAGE不对称的亚硝胺→食管癌肌源性：结蛋白（Dm）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白基化→基因低甲基化（可传代）1956年亚硝胺和1961年黄曲霉毒素的致癌作用相继被发现石蜡包埋材料提取的DNA质量较差，可用变性引物对所提取的基因组DNA进行整体扩增

一、自发性肿瘤

种系：大鼠的自发肿瘤不如小鼠多见，大动物更为少见

Sinclair猪到一岁时有85%可发生恶性黑色素瘤

品系：

C3H小鼠―乳腺癌发病率为97%BALB/c―乳腺癌发病率低

AKR小鼠―淋巴细胞性白血病发病率为70%~90%

近交系SJL/J小鼠―淋巴瘤(何杰金病)自发率高达91%

缺点：发病迟,发病时期不集中,发病率也不稳定

年龄:一般而言,动物年龄越小,对化学致癌物越敏感,17

二、诱发性肿瘤

优点：发生率、发病时间、发生部位及组织学类型均易控制实验结果重复性相对较好

1.化学诱癌动物肿瘤模型

1775年英国医师Pott扫烟囱阴囊癌

1914年,日本学者山极和市川煤焦油皮肤癌

1934年Yashida用邻氨基偶氮甲苯诱发大鼠肝癌成功我国从1960年代开始进行化学诱癌动物模型的研究

1956年亚硝胺和1961年黄曲霉毒素的致癌作用相继被发现

二、诱发性肿瘤18

(1)化学致癌物▲诱发时间相对较短▲有剂量-效应关系▲基因毒化学致癌物一般具有高度亲电子性，与生物大分子中富于电子的亲核残基相结合,

影响硷基对的正常配位或大分子的结构与功能→正常细胞的癌变.▲直接致癌物和前致癌物（间接致癌物）

肿瘤研究方法课件19

常见化学致癌物:1)多环碳氢化合物:25种以上,以煤焦油的主要成分3,4-苯并芘和3-甲基胆蒽的致癌性最强

2)氨基偶氮化合物:二甲基氨基偶氮苯亦称二甲基黄(奶油黄),3’-甲基-4,4’-二甲基氨基偶氮苯(3’-Me-DAB)

3)芳香胺类:

苯胺印染工厂吸入乙萘胺在肝变为氨基苯经肾排出联苯胺→膀胱癌

2-乙酰氨基芴(2-AAF)

4)亚硝胺类:

亚硝酸盐+二级胺→亚硝胺类化合物强致癌物致癌谱甚广不同分子的亚硝胺化合物仍有一定的器官亲和性对称衍生物如二烷基亚硝胺→肝癌不对称的亚硝胺→食管癌常见化学致癌物:20

5)霉菌毒素:种类较多首推黄曲霉毒素(aflatoxin),存在于霉变的花生、玉米及谷物中,

6)金属元素:

砷、铬、镍、→肺癌镉→前列腺癌.

(2)影响化学致癌的因素

肿瘤研究方法课件211)

动物方面品系:

诱发肝癌时：F-344大鼠对DEN和2-AAF的敏感性要比其它品系的大鼠高诱发皮肤肿瘤：BALB/c和SENCAR品系小鼠对DMNU、DENU的敏感性大大高于Swiss品系小鼠性别:

2AAF诱发肝癌：♂小鼠60%发生肝癌,♀小鼠不敏感.F-344大鼠,♀比♂更敏感年龄:

一般而言,动物年龄越小,对化学致癌物越敏感,

敏感性：胎鼠>新生鼠>成年鼠肿瘤研究方法课件222)化学致癌物方面剂量阈值:

启动因子（initiator）不表现明显的剂量阈值促癌因子（promotor）则有剂量阈值一般的化学致癌物往往兼有启动和促癌的作用,因此仍可表现有剂量阈值如3’-Me-DAB(60ppm)致癌强度:

诱发大鼠肝癌总剂量:

DAB为1000mg3’-Me-DAB为600mg,2-AAF为250mg,DMN只需100mg;

肿瘤研究方法课件23诱癌潜伏期:

诱发肝癌：AFB1需时约1年,3’-Me-DAB与2-AAF约半年左右,DEN一般只需3个月;诱癌靶器官:

诱癌谱：相对专一，如3’-Me-DAB一般只引起肝癌,

较广，如亚硝胺类可诱发多器官肿瘤;化学致癌物的相互作用:

多数协同作用而加速致癌,

少数会产生拮抗作用.

有的化学物质单独使用时本身不致癌,但可增强致癌物作用（促癌物）肿瘤研究方法课件24人肺腺癌细胞株LC-2/ad→α1-抗胰蛋白酶3)芳香胺类:苯胺印染工厂吸入乙萘胺在肝变为氨基苯经肾排出核型二倍体非整倍体或假二倍体非整倍体▲普通倒置相差光镜:活细胞的形态,细胞间桥,分泌颗粒,重叠生长,集落形成或贴壁率（platingefficiency）▲Stewart等获得13个MMTV-LTR/myc融合基因的转基因小鼠系,*100余种人类恶性肿瘤裸小鼠移植模型：38%的实验小鼠胃有淋巴滤泡增生,DNAmicroarray:阵密度很高的玻片基质或胶膜基质喂正常饲料(代表1周)通过电泳分析酶切片段即可知甲基化状态NondenaturingPAGE(300V,5h,silverstaining)3)芳香胺类:苯胺印染工厂吸入乙萘胺在肝变为氨基苯经肾排出↓FlowLaboratories;GIBCO较广，如亚硝胺类可诱发多器官肿瘤;慢性RNA肿瘤病毒：潜伏期较长(4～12月)，大部分动物白血病病毒属于本组较低—前列腺癌、乳腺浸润癌、淋巴网织系统肿瘤和白血病切片染色不能用HE，而用甲基绿五、肿瘤基因甲基化水平的检测↘CCmGG

3)诱癌方案（carcinogenicregimen）和方法

半年后12周后喂正常饲料(代表1周)喂含0.06%3’Me-DAB的饲料喂含0.02%2-AAF的饲料部分肝切除人肺腺癌细胞株LC-2/ad→α1-抗胰蛋白酶半年后125苯并蒽(Benzanthracene)直接涂擦皮肤注射至皮下产生皮肤癌产生纤维肉瘤苯并蒽(Benzanthracene)直接涂擦皮肤注射至皮下26非基因毒致癌物(non-genotoxiccarcinogen)

美国公布的301种化合物中,162种可致鼠类肿瘤其中36%不引起细胞DNA的改变

44%不引起细胞突变致癌机制？促进细胞增殖？抑制细胞凋亡？其它未知？肿瘤研究方法课件272生物因子诱发动物肿瘤模型

(1)

病毒诱发动物肿瘤模型

1908年Ellermann和Bang—白血病鸡的无细胞滤液诱发鸡白血病获成功白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮肤癌、肾癌等,与病毒感染有关

1)DNA病毒多瘤病毒(PyV)

疱疹病毒(herpesvirussylvilagas)

2)

RNA病毒急性RNA肿瘤病毒：潜伏期较短(3～4周),大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、个别小鼠白血病病毒(如Abl-MuLV)都属于本组.

该组病毒基因组结构常有缺陷,需辅助病毒协助才能复制慢性RNA肿瘤病毒：潜伏期较长(4～12月)，大部分动物白血病病毒属于本组肿瘤研究方法课件28

（2）其它生物因子诱发的动物肿瘤模型

幽门螺杆菌感染SPF级的BALB/c小鼠,22月以后,

38%的实验小鼠胃有淋巴滤泡增生,25%的小鼠胃出现形态类似人胃粘膜相关淋巴瘤的病变（B细胞淋巴瘤）

29

3.转基因动物肿瘤模型▲Stewart等获得13个MMTV-LTR/myc融合基因的转基因小鼠系,

其中两株c-myc启动子为MMTV-LTR启动子中糖皮质激素受体反应元件所取代,在早期妊娠时即发生自发性乳腺癌。▲Chisari等

HHBV的S基因、病毒增强子和X基因→转基因小鼠,HBsAg的积聚引起内质网明显扩张,出现肝细胞毛玻璃样改变,100%小鼠发生肝脏肿瘤

X基因和病毒增强子的质粒→X基因转基因小鼠,21月龄时,两个品系转基因小鼠肝肿瘤发生率分别为

75%82.8%3.转基因动物肿瘤模型30

三、移植性肿瘤

可移植瘤株：将一种动物肿瘤移植到同系同种或异种动物,经传代（20代）,组织形态特征逐渐稳定，即成为同种或异种动物的可移植瘤株。移植瘤来源：动物自发性肿瘤或诱发性肿瘤我国用615近交系小鼠的自发瘤建立了：肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株用诱发瘤建立了：小鼠宫颈癌（U27及U14）小鼠前胃癌（Fc）肝细胞癌等移植瘤株。三、移植性肿瘤31

近交系动物的应用：

1962年,苏格兰医师Dssacson和Cattanach发现（裸小鼠）

*移植性人肿瘤裸鼠模型广泛应用

1、免疫缺陷动物

(1)T细胞免疫功能缺陷动物

裸小鼠：*先天性胸腺发育不良(妊娠14～15天可见少量胸腺痕迹,并非全无胸腺)*胸腺依赖性T细胞明显减少或缺乏,*B细胞仍然存在,但功能低下,免疫球蛋白以IgM为主,*NK细胞有较强活力。

纯合子的裸大鼠：基因符号rnu。特征与裸小鼠相似

无胸腺大鼠近交系动物的应用：32(2)B细胞免疫功能缺陷动物

B细胞功能衰退,血浆IgM、IgG低下,T细胞功能尚属正常

CBA/N系小鼠

Arabian和Quarter马

(3)联合免疫缺陷及其它免疫缺陷动物

CBA/N—NU小鼠T、B淋巴细胞功能均缺陷;

严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）：突变基因scid位于第16对染色体纯合子小鼠T、B淋巴细胞极度低下,NK细胞和抗原传递细胞功能尚正常先天性联合免疫缺陷型小鼠：

NK细胞、T、B细胞功能联合缺陷裸小鼠：

缺点：*需在germ-free或SPF条件下饲养，较苛刻

*平均寿命仅14～30d。肿瘤研究方法课件332、人肿瘤免疫缺陷动物模型

移植成功率:取决于

移植方法：人癌组织直接移植的成功率平均为30%

人癌细胞株为60～70%

肿瘤本身：成功率最高—结肠癌、胃癌、黑色素瘤;

其次—胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植、宫颈癌、食管癌等;

较低—前列腺癌、乳腺浸润癌、淋巴网织系统肿瘤和白血病

裸小鼠品系：人前列腺癌—BALB/c成功率仅2%（3/150）

NMRI裸小鼠可达35%（6/16）

其它：接种部位宿主遗传背景年龄和建康状况等2、人肿瘤免疫缺陷动物模型34(1)人组织裸鼠诱癌模型

诱发鼻咽癌青少年慢性鼻咽增殖体炎鼻咽活检或刮除组织移植于NC系裸小鼠二亚硝基哌嗪（NDP）为致癌剂鼻咽上皮增生巴豆油A因子（TPA）为促癌剂

乳头状增生、不典型增生原位癌

诱发肺癌裸鼠体内人类气管、支气管培养成功也为用人材料诱发肺癌的实验奠定了基础肿瘤研究方法课件35(2)人肿瘤裸鼠移植模型

*1969年丹麦的Ryggard人结肠癌移植于裸小鼠

*100余种人类恶性肿瘤裸小鼠移植模型：癌肿肝、肺、胃、结肠、食管、胰腺、乳腺、前列腺、鼻咽、淋巴造血系统肿瘤软组织肿瘤其它黑色素瘤、视网膜母细胞瘤*1978年Festing首次进行裸大鼠人癌异种移植*1983年我国建成甲胎蛋白阳性裸大鼠人肝癌模型LTNR与LTMR2两株(2)人肿瘤裸鼠移植模型36(3)人肿瘤转移裸鼠模型我国始于80年代中期

肺癌、肝癌转移及胃癌肝转移和淋巴道转移等1)人肺癌高转移裸小鼠模型吴秉铨等将6株人肺癌细胞系移植BALB/cA,nu/nu/JCLB裸小鼠其中一株肺巨细胞癌细胞系移植建成高转移模型,定名为PG

带瘤存活30天以上裸小鼠中

淋巴结转移(29/30)肺转移(26/30)

传17代后,瘤组织再移植裸小鼠(存活30天)

淋巴结转移(12/12)肺转移(9/12)转移率达100%

2)人肝癌高转移裸小鼠模型孙肪宪,汤钊猷等用30例人肝癌组织直接移植于4～6周龄的BALB/cA,nu/nu裸小鼠,

移植部位在小鼠肝实质内或肝包膜下其中一例39岁男性(巨块型肝细胞癌伴肝内播散和淋巴结转移)其移植瘤育成人肝癌高转移裸鼠模型,定名为LCI-D-20

鼠间连续传代(16代)成功率100%,间期为20天肺、淋巴结及肝内转移(72/72),腹腔种植转移(50/72),转移率达100%(3)人肿瘤转移裸鼠模型37

3)其它胃癌肝转移杨善民等用人低分化胃粘液腺癌细胞系MGC80-3在BALB/c裸小鼠建成移植瘤后再用移植瘤单细胞悬液接种于裸小鼠脾包膜下

肝内胃癌转移率达60%

用CCl4处理裸小鼠,肝内胃癌转移率可达100%,其它脏器则未见转移淋巴结转移李斯德等将人小细胞癌NCI-H128细胞系接种裸小鼠腹股沟、腋窝和颌下淋巴结出现转移淋巴结转移率达100%

383应用

肿瘤的生物学特性浸润转移

临床治疗基因治疗导向治疗

药敏测定法（SRC）实验可评价率为93%

新抗癌药物开发筛选

肿瘤研究方法课件39肿瘤研究方法课件40

MolecularOncology

SomeMolecularMethodologyinTumorResearch

41一、基因变异的诊断

基因表达异常

肿瘤基因突变：转位，重排Southernblot，PCR

点突变DGGE

硷基缺失CDGESSCP

基因丢失：SSCPMicrosatellitesanalysisDGGE=DenaturingGradientGelElectrophoresisCDGE=ConstantDenaturingGelElectrophoresisSSCP=SingleStrandConformationPolymorphism一、基因变异的诊断DGGE=DenaturingGradi42PCR-SSCP:year1989,OritaMGene

PCR

HomozygoteHetrozygoteHeating(50℃)for10min+formamideNondenaturingPAGE(300V,5h,silverstaining)PCR-SSCP:year1989,OritaM43PCR-SSCP灵敏度高，一个硷基的改变可在电泳速度上反映出来但DNA片段的大小与灵敏度有关100-300bp突变检出率97%300-500bp检出率67%以200bp左右为佳PCR-SSCP44支原体：以核酸（DNA）荧光染色即H-stain(Hoechst33258，12例癌周肝硬化组织：阴性小鼠宫颈癌（U27及U14）（同时用同位素对PCR产物进行标记）体外正常细胞恶性转化的鉴定核型及染色体观察:组织细胞源性：α-1抗胰蛋白酶、α-1抗糜蛋白酶、CD68DNA模板制备（从石蜡组织中提取）G带核型分析鉴别同种肿瘤细胞酶活性保持(HTC→酪氨酸氨基转移酶)、变化↓离心，3min用DOP-PCR只需石蜡包埋材料DNA50pg(相当于5-10个细胞）即可进行CGH分析，而常规方法需至少200个细胞，两者CGH的图形（profile)是相同的代（20代）,组织形态特征逐渐稳定，即成为同种12个T可结合mRNA的polyA上体外研究(InVitro)组织细胞源性：α-1抗胰蛋白酶、α-1抗糜蛋白酶、CD68二亚硝基哌嗪（NDP）为致癌剂鼻咽上皮增生NK细胞和抗原传递细胞功能尚正常肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌→ACTHPCR-SSCP的主要步骤：DNA模板制备（从石蜡组织中提取）脱蜡：少许石蜡组织放入Eppendorf管+1ml二甲苯

65℃，5分钟→离心，5分钟，弃上清重复一次

1mlEtOH,振摇后离心5分钟，弃上清

1mlEtOH(70%),振摇后离心5分钟，弃上清

真空离心5分钟，使干燥

支原体：以核酸（DNA）荧光染色即H-stain(Hoech45消化：180mlpH8.0TE+20mlbuffer+10mlproteinaseK(20mg/ml)↓55℃,3-5h

加50mlChelex-100(25%水溶液)↓55℃,1h↓100℃,10min↓spin,3min提纯DNA：上清+200mlphenol,剧烈振摇↓离心，3min

上清+phenol/choroform,振摇↓离心，3min

水相+25mlNaOAc3M,1mlglycogen,750mlEtOH(pure)↓-20℃,overnight↓spin15min,at4℃↓pelletswashedwithEtOH70%↓spin,pelletsresuspendedin100-200mlTE,pH8消化：180mlpH8.0TE+20mlbuff462.RunPCR

注意：PCR产物最好在200bp左右琼脂糖电泳条带清晰PCR产物run非变性PAGE

制胶（36%MDE胶，or6%polyacrylamide）↓稀释样品（1mlPCR产物+4ml去离子水）↓alkalinedenature,(+1mlNaOH,4ml去离子水）↓50℃水浴10min后+stopsolution2ml)↓12ml/well↓20℃恒温，300伏恒压下电泳5hAlkalinestocksolution:0.5MNaOH+10mMEDTAStopsolution:1mlformamide(99%pure)+20ml0.5MEDTA(pH8.0)+50ml1%bromophenol+25ml1%xylenecyanol2.RunPCRAlkalinestocksolut474.胶染色

PAGE胶作记号（左下角切去小⊿）入10%醋酸固定20min↓

胶用去离子水洗三次，每次2min↓

胶入硝酸银溶液反应30min↓

胶用去离子水洗一次，约半分钟↓胶入还原液还原显色（时间依需要而定）↓胶入10%醋酸终止反应，约5分钟↓胶在80℃下真空干燥2小时4.胶染色48P53基因exon5突变（PCR-SSCP）

NTLNTLP53基因exon5突变（PCR-SSCP）49PCR-SSCP的应用：

1.经PCR-SSCP确定DNA片段有突变，该片段经测序可确定突变的形式和定位，可避免因测序或PCR反应出现的碱基配对差错造成的假阳性

2.在无非特异性电泳条带情况下，可以初步确定有无基因的杂合性丢失（LossofHetrozygote,LOH)PCR-SSCP的应用：50二、检测基因的丢失和扩增比较基因组杂交

ComparativeGenomicHybridization,CGH

分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合优点：

1.新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可进行CGH研究

2.被测样品只需数mg甚至不到1mg的DNA二、检测基因的丢失和扩增51R/G低度扩增高度扩增丢失不同荧光（红/绿）标记基因组DNA片段（500-2000bp）人Cot-1DNA对正常人染色体进行原位分子杂交被测DNA参照DNA退火及预杂交R/G低度扩增高度扩增丢52石蜡包埋材料提取的DNA质量较差，可用变性引物对所提取的基因组DNA进行整体扩增DegenerationOligonucleotidePrimedPCR(DOP-PCR)Firststep:Primer:5′CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3′(DOP)酶：消除3′→5′外切酶活性的T7噬菌体DNA聚合酶条件：宽松条件（Lowstringency)30℃/5min→37℃/2min→96℃/2minfor5cycles石蜡包埋材料提取的DNA质量较差，可用变性引物对所提取的基因53Secondstep:Template:theproductofthefirststeprunningPrimer:DOP酶：Taq聚合酶条件：95℃/5min后进入循环

94℃/1min→56℃/1min→72℃/2minfor35cycles→72℃/5min用DOP-PCR只需石蜡包埋材料DNA50pg(相当于5-10个细胞）即可进行CGH分析，而常规方法需至少200个细胞，两者CGH的图形（profile)是相同的切片染色不能用HE，而用甲基绿Secondstep:54CGH的应用：为搜寻肿瘤的癌基因或抑癌基因确定范围肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数增加，往往提示该位置可能包含已知或未知的癌基因有扩增肿瘤细胞染色体某一位置上DNA序列拷贝数减少或缺失，提示该位置可能包含已知或未知的抑癌基因丢失

CGH发现MYCN，MET与胃癌相关CGH的应用：55区分良恶性病变，临床上估计预后

16例前列腺癌CGH显示染色体异常占81%5例良性前列腺增生全部阴性

67肝细胞癌CGH显示:1q,8q,20q,17q↑4q,8p,13q,16q↓12例癌周肝硬化组织：阴性

53例淋巴结阴性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q异常，预后差

区分良恶性病变，临床上估计预后56三、检测细胞基因表达谱的差异消减杂交抑制消减杂交

cDNA代表性差异分析

SAGEDNAmicroarraymRNA差异显示（mRNAdifferentialdisplay)RT-PCR+测序电泳，经典，可重复性可展示10000-15000种mRNA的表达三、检测细胞基因表达谱的差异57提取高质量的总RNA，DNA酶处理（同时用同位素对PCR产物进行标记）HHBV的S基因、病毒增强子和X基因→转基因小鼠,基化→基因低甲基化（可传代）再用移植瘤单细胞悬液接种于裸小鼠脾包膜下(1)人组织裸鼠诱癌模型二、检测基因的丢失和扩增↓DGGE=DenaturingGradientGelElectrophoresis↓CDGE=ConstantDenaturingGelElectrophoresisHpaII+MspI酶切法1914年,日本学者山极和市川煤焦油皮肤癌胶用去离子水洗三次，每次2min敏感性：胎鼠>新生鼠>成年鼠近交系SJL/J小鼠―淋巴瘤(何杰金病)自发率高达91%酸式亚硫酸钠→（C→T）或→（mC→C）与CpG甲基化有关的内切酶位点的序列发生转变移植瘤来源：动物自发性肿瘤或诱发性肿瘤人肺小细胞癌细胞株LU-165→抗利尿激素;▲Chisari等实质是RT-PCR引物设计很有特点锚定引物：

12个T可结合mRNA的polyA上T12MNM=A，G，CN=A，G，C，T

据排列组合，一种T12MN可与1/12的mRNA结合随机引物：可在与polyA末端不同距离的多个位置上结合差异显示的产物是长度不一的cDNA片段的混合物

提取高质量的总RNA，DNA酶处理实质是RT-PCR58差异显示的技术路线

提取高质量的总RNA，DNA酶处理↓用锚定引物T12MN进行逆转录↓用相同的T12MN引物及随机引物进行PCR扩增（同时用同位素对PCR产物进行标记）↓测序胶电泳分离PCR产物↓切下差异表达的条带，用相同引物进行二次PCR扩增↓PCR产物制成探针

Northernblot验证

差异显示的技术路线59*相对较敏感：200个细胞的总RNA足够进行差异分析*低丰度mRNA的显示不理想对策：（1）先通过消减杂交使差异片刻富集（2）二轮PCR扩增（巢式PCR），第二轮的引物在3′端多2个碱基，使与之匹配的模板减少，