精液冷冻技术课件

精液冷冻技术精液冷冻技术精液冷冻的历史（一）探索

1776年，Spallanzani发现精液在自然冰雪中冷冻后复温部分精子恢复活力

1938年，Jahnelv发现精液储存于-79℃

的玻璃管40天后复温部分恢复活力

1940年，Shettles置精液于毛细玻璃管内-196℃

储存，存活率不超过10%突破

1949年，Polge等发现用甘油作为冷冻精子的保护剂精液冷冻的历史（一）探索精液冷冻的历史（二）奠基

1954年后的十年中，Sherman发明了使用10%甘油作保护剂，用-196℃

液氮蒸气作制冷剂的方法，获得76%的冷冻生存率，得到普遍认可发展在Sherman发明的方法基础上，从冷冻方法、保护剂种类等方面的研究发展迅速稳定经过多年的发展，精子冷冻技术相对稳定，探索不止

精液冷冻的历史（二）奠基精液冷冻的原理（一）一、冷冻精液长期储存的原理一定的低温条件下细胞内的分子运动速度减慢甚至停止细胞代谢降低，处于休眠状态一般认为-196℃

的液氮是安全的

精液冷冻的原理（一）一、冷冻精液长期储存的原理精液冷冻的原理（二）二、冷冻对精子的损伤机理

1、溶质损伤效应：（慢速冷冻损伤）

温度降低至冰点细胞外液中的水分先形成冰晶细胞外液电解质浓度增加，渗透压增高水分从细胞内流向细胞外，细胞发生收缩胞外冰晶的不断形成使高渗状态和细胞收缩持续进行过度暴露在高浓度溶质环境或过度收缩，引起损伤精液冷冻的原理（二）二、冷冻对精子的损伤机理温度降低至冰点细精液冷冻的原理（三）2、冰晶的机械损伤效应：（快速冷冻损伤）温度降低达到细胞内冰点未能转移至胞外的水分形成冰晶破坏胞内的超微结构，引起死亡Wolley等人的研究显示，超微结构的变化是发生在融化期间或融化之后精液冷冻的原理（三）2、冰晶的机械损伤效应：（快速冷冻损伤精液冷冻的原理（四）三、精液冷冻的基本原理冷冻损伤是肯定的在两种损伤之间寻找平衡点，即最佳的降温速率使两种损伤的总和达到最小，得到最大的冷冻生存率实现起来非常困难冷冻保护剂的出现是一大突破精液冷冻的原理（四）三、精液冷冻的基本原理冷冻保护剂的作用机理（一）一、冷冻保护剂的分类1.根据化学结构分类：醇类、酰胺类、高分子多糖类、单糖类、蛋白质类、无机盐类等2.根据作用机理分类：（1）渗透性冷冻保护剂：丙三醇、DMSO、乙二醇等（2）非渗透性冷冻保护剂：右旋糖酐、羟乙基淀粉、卵黄等冷冻保护剂的作用机理（一）一、冷冻保护剂的分类冷冻保护剂的作用机理（二）二、渗透性冷冻保护剂的作用机理1、渗入细胞内，降低细胞内外渗透压的差距。当细胞外冻结时，减轻细胞皱缩的程度和速度2、细胞外保护剂的存在，可以降低细胞外液中溶质的浓度，减少高浓度溶质对细胞的损坏3、能与细胞内水分及电解质结合的特性，导致水合结构蛋白的稳定，发挥抗冻作用4、仅对慢速冷冻有保护作用冷冻保护剂的作用机理（二）二、渗透性冷冻保护剂的作用机理冷冻保护剂的作用机理（三）三、非渗透性冷冻保护剂的作用机理此类物质不能进入细胞，冷冻时促进细胞内水分外溢，细胞发生皱缩，从而减少了细胞内的冰晶形成

对快速冷冻和慢速冷冻都有保护作用

卵黄的作用：卵磷脂能稳定精子的细胞膜，阻止顶体膜破裂，抵抗“温度休克”冷冻保护剂的作用机理（三）三、非渗透性冷冻保护剂的作用机理冷冻保护剂的作用机理（四）四、冷冻保护剂的联合作用1.冷冻保护剂剂量增加，其低温保护作用增强2、冷冻保护剂的毒性作用3、两种毒性机理不同的冷冻保护剂合用，可以达到相同的效果，而减少毒性作用4.渗透性冷冻保护剂与非渗透性冷冻保护剂联合使用冷冻保护剂的作用机理（四）四、冷冻保护剂的联合作用冷冻的程序和方法（一）一、冷冻过程中精子通过的温度阶段温度休克阶段室温~+5℃

冰晶的潜热阶段+5℃~-5℃

冰晶的形成阶段-5℃~-15℃

再结晶阶段-15℃~-80℃

储存阶段-80℃~-196℃

冷冻的程序和方法（一）一、冷冻过程中精子通过的温度阶段冷冻的程序和方法（二）1、温度休克阶段温度休克：指细胞不是由于直接的冷却作用，而是由于温度急剧变化而造成的损害。许多种属的细胞比较明显，如牛精子在2℃/分的降温速率下，就可能死亡人类精子对温度休克有相当的抵抗力，1℃/分的降温速率比较合适2、冰晶的潜热阶段在通过+5℃~-5℃

的温度阶段时，由于冰晶形成放出热量，温度突升高。为了减少潜热释放、温度升高对精子的损伤，应快速通过。冷冻的程序和方法（二）1、温度休克阶段冷冻的程序和方法（三）3、冰晶形成阶段精液作为一个整体从液相转变成固体相，伴随冰晶形成及由此产生的急骤温度变化。在添加冷冻保护剂后，以5-7℃/分的速率通过，能获得理想的生存率4、再结晶阶段温度低于-30℃

时，由于冰晶的生长和相互结合，产生温度波动，再结晶改变了细胞内的电解质平衡，造成了进一步损伤，这种现象称为迁移性再结冰。一般认为，这种现象一直维持至-80℃。快速通过能避免这种损伤。冷冻的程序和方法（三）3、冰晶形成阶段冷冻的程序和方法（四）5.储存阶段虽然低于-80℃细胞内已无结冰现象，但经研究证实，即使在-100℃下储存，精子生存率仍会逐步的下降，因为某些酶类还具备一定的活性，使细胞进行简单、缓慢的代谢。一般认为，在-196℃液氮中保存是安全的。冷冻的程序和方法（四）5.储存阶段冷冻的程序和方法（五）二、冷冻的程序和方法根据精子冷冻时需要通过的温度阶段，冷冻程序设计的原理基本相同，但在实现的方法上却有很多种，主要有以下几种：1、二步法将精液置于液氮水平面上一个固定距离一定时间，然后浸入液氮中储存。冷冻的程序和方法（五）二、冷冻的程序和方法冷冻的程序和方法（六）2、三步法将精液分别置于液氮水平面上两个不同的距离一定时间，然后浸入液氮中储存。3、多步法利用程序降温仪来实现4、其它方法颗粒法、一步法、冰箱预冷等冷冻的程序和方法（六）2、三步法冷冻的程序和方法（七）三、精液的冻贮方式颗粒法：设备简单，易污染，难标记安瓿法：易标记，封口后不易污染，火焰熔封较繁琐，易爆炸或破裂麦管法：易标记，降温均匀，可直接授精，封口较繁琐，储存管理不便塑料冻存管法：易标记，易封口，易储存管理，复温偶有爆炸注射器法：可直接授精，储存管理不便，不宜大量冻贮冷冻的程序和方法（七）冷冻保护剂的种类与配制（一）一、冷冻保护剂的种类1、单纯甘油型2、甘油复合型甘油-卵黄-枸橼酸钠型（G-Y-C型）甘油-Tyrode液型TEST-Tris-甘油-卵黄-枸橼酸钠型甘油-蔗糖-HEPES-HTF型3、无甘油复合型冷冻保护剂的种类与配制（一）一、冷冻保护剂的种类冷冻保护剂的种类与配制（二）二、甘油-卵黄-枸橼酸钠型冷冻保护剂的配制冷冻保护剂配方(总量=20ml)CPM：SEMEN甘油(ml)卵黄(ml)枸椽酸钠(mg)葡萄糖(mg)纯水(ml)

1：1

2.8

4.0

377

169

13.2

1：2

4.2

6.0

565

250

9.8

1：3

5.6

8.0

754

338

6.4冷冻保护剂的种类与配制（二）二、甘油-卵黄-枸橼酸钠型冷冻保影响精液冷冻质量的因素关键因素：冷冻程序、冷冻保护剂其他因素：禁欲时间：３-５天精液取出至冷冻时间：１小时之内冷冻保护剂的添加方式：室温，缓慢添加复温方式与时间：３７℃水浴１０分钟精液分析的标准化影响精液冷冻质量的因素关键因素：冷冻程序、冷冻保护剂精液冷冻技术的新进展

---玻璃化冷冻（一）玻璃化：液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程优点：快速冷冻，不形成冰晶实现玻璃化的途径：极大提高冷却速率、增加溶液浓度技术上的难点：