病理学研究进展

病理学研究进展

病理是医学的一个重要桥梁学科，已有300多年的历史。在18和19世纪初,人们依赖肉眼和简单的放大镜观察病变组织,产生了器官病理学。1843年,德国病理学家Virchow将显微镜用于观察病变部位组织细胞结构的改变,病理学进入细胞病理学,随着切片技术和染色技术的发明,开创了组织病理学技术最基本的组织制片和HE染色常规技术。20世纪50年代出现了生物组织标本制备超薄切片技术,病理学研究从细胞水平深入到亚细胞水平,由此产生了超微结构病理。半个多世纪以来,科学技术不断的进步,许多新知识、新理论广泛应用于病理学各个领域。特别是近20多年一系列相关新方法、新技术的相继建立以及细胞生物学、分子生物学、环境医学、现代免疫学、现代遗传学等新兴学科迅速兴起,对病理学科的发展产生了深远的影响,带来了新的理论和技术。一、免疫组化染色免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)是利用抗原抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量研究的一种技术方法。免疫组织化学技术不仅有较高的敏感性、特异性、简便性等优点,还能将形态学改变与功能、代谢变化相结合,基因水平和蛋白质水平检测相结合,细胞水平和超微结构水平相结合,因此,在所有新技术中,免疫组织化学技术是最重要和最具影响力的一种特殊染色方法,被誉为病理学的“棕色革命”。石蜡组织免疫组化技术的发展从单克隆抗体以及以酶标抗体法为基础的高敏感ABC试剂问世到1991年发明的加热抗原修复技术(AR)成为免疫组化发展史上重要的里程碑。但免疫组化的标准化量化问题尚未解决,王文勇等探讨免疫组化技术标准化要从免疫组化染色前技术的标准化(组织固定、取材、脱水、包埋的标准化);组织制片标准化;抗原修复标准化;对照实验正确设立;试剂标准化(抗体和检测系统标准化);免疫组化具体操作步骤的标准化;免疫组化染色结果判读标准化;医学实验室认证等方面去实现。此外,全自动免疫组化染色仪的使用可以提高标准化程度,减少手工操作染色带来的人为误差。从现有科技水平来看,经过努力是完全可能建立起一套切实可行的定量免疫组化技术,为当代个体化靶向治疗以及分子医学提供强有力的工具。二、检测细胞异质性原位杂交(insituhybridization,ISH)是应用标记的已知序列核苷酸片段作为探针,通过杂交直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上检测和定位某一特定的靶DNA或RNA的存在。该方法具有2个特点:1)基因水平的检测,即直接检测DNA或RNA;2)可以明确定位,在保存组织结构同时揭示组织细胞的异质性,细胞基因表达的异质性和细胞器中的区别定位。原位杂交与免疫组织化学在具体实验操作中有许多相似之处。滕孝静等将自动免疫组化染色仪应用于EBER(Epstein-BarrencodedRNAs)原位杂交技术,得到了满意的染色效果。1986年使用荧光标记DNA探针,开启了荧光原位杂交(FISH)时代,与原位杂交技术相比,FISH更加安全、快速、特异性好、定位准确。目前已应用于外科病理学诊断中,为乳腺癌、肺癌、胃癌等实体肿瘤进行早期诊断、个性化治疗以及愈合判断。但FISH技术操作较为繁琐且实验结果较不稳定。陈顺平等通过实践,提出在FISH实验中控制酶消化的稳定以及判断细胞消化效果是对操作者必备要求,合适的消化程度是实验的关键,也是提高杂交率和诊断准确率的前提。三、原位pcr检测肺癌pten基因表达原位多聚酶链式反应技术(polymerasechainreaction,PCR)是将在冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片中的核酸片段进行高效扩增,来检测细胞内单一拷贝或低拷贝的待测核酸序列。主要应用于病原体检测,内源基因检测,基因突变、基因重排和染色体易位。辛丽红等应用原位PCR技术检测肺癌石蜡标本PTEN基因DNA表达,结果发现PTEN基因在肺癌组织中的表达较正常肺组织中的低,而该基因的表达与肺癌的病理类型、组织分化程度、临床分期,以及有无淋巴结转移密切相关。临床病理最常见的PCR技术是使用福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)组织进行扩增。鄢丽敏等选取正常甲状腺FFPE标本应用“一步法”、酚/氯仿抽提法和试剂盒法提取总DNA,并应用传统PCR法和巢式PCR法对线粒DNA(mtDNA)的D环区进行扩增,结果得出用蛋白酶K消化、酚/氯仿纯化法提取的FFPE组织标本DNA,质量可靠,巢式PCR技术是从石蜡标本中扩增长片段DNA的有效方法。目前的原位PCR方法还有操作复杂、假阳性、石蜡包埋标本扩增效率低、无法精确定量等诸多问题,需要广大病理工作者在实践过程中不断优化试验条件,完善和提高这一技术。四、生物学方面的研究显微切割术(microdissection)是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统从冷冻或石蜡包埋组织切片、细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞,或单个细胞甚至目标染色体,再进行有关的分子生物学方面的研究。其具有高度敏感性和高度特异性的统一,尤其是在需要研究的细胞只占样本中细胞的少数,或者需研究的细胞呈散在分布时,显微切割的重要性尤为明显。目前,激光捕获显微切割(LCM)是最先进的组织纯化病理技术。LCM是基于病理形态进行细胞纯化,可较好地反映体内细胞的基因表达。王文勇等研究证明福尔马林固定的石蜡切片可作为LCM技术及后续DNA分析的材料来源,将其与基因组扩增技术结合,可为肿瘤基因组学和分子病理学研究提供重要的手段。如今激光捕获显微切割技术已经与PCR、蛋白质组学、组织微阵列技术和临床病理诊断工作等结合起来,为我们研究疾病的病因、发病机制、临床治疗提供更精确的服务。五、lscm的观察方法激光扫描共聚焦显微镜(1aserscanningconfocalmicroscopy,LSCM)又称粘附式细胞仪,是采用激光作为光源,在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置,并利用计算机对所观测的对象进行数字图像处理的一套观察、分析和输出系统。LSCM技术具有高灵敏度、高分辨率等特点,可进行定性、定量、定时、定位的分析测量。在形态学观察方面,可对标本各层分别成像,对活细胞行无损伤的“光学切片”,有“显微CT”之称。LSCM在抗原表达、荧光定位、样本内部结构等形态观察方面有着无可比拟的优势。刘芙蓉等通过LSCM观察乳腺癌细胞内在雌激素和雌激素受体拮抗剂刺激下,雌激素受体α(ERα)和转移相关蛋白1(MTA1)发生的共定位改变,为深入探讨ERα和MTA1的分子生物学作用奠定了初步基础。LSCM还可以进行细胞内PH值的测量、膜电位测量、光漂白后荧光恢复技术、钙离子的测量。苏明华等使用全细胞膜片钳技术联合LSCM研究川芎嗪(TMP)对大鼠海马神经元细胞膜L型钙通道电流的作用和对神经细胞内钙的影响,探讨其治疗阿尔茨海默病(AD)的机制,结果表明TMP具有对海马神经元LCa通道和细胞内钙库释放的双重抑制作用,防止神经元细胞内钙超载,这可能是其治疗AD的机制之一。六、微阵列共聚体对不同基因组间dna产业竞争的影响比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)是在染色体荧光原位杂交技术的基础上发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术,它通过单一的一次杂交实验即可在整条染色体或染色体区带水平对不同基因组间DNA序列拷贝数的差异进行检测并定位。二十世纪末Solinas-Toldo等率先将传统经典的CGH技术与生物芯片-微阵列技术相结合建立了微阵列比较基因组杂交(aCGH)。CGH及aCGH不仅适用于培养细胞和新鲜组织样本的研究,还可用于FFPE组织样本的研究以及因DNA量过少而经PCR扩增的样本的研究,不需制作细胞的中期染色体。李栋梁等采用全基因组Array-CGH检测2例FFPE横纹肌肉瘤组织的DNA拷贝数变化,Array-CGH及其步骤的优化适于FFPE组织材料DNA拷贝数的检测,获得了与文献报道较为一致的检测结果。目前CGH已应用于肿瘤发病的分子机制等方面的研究。七、生物基因芯片生物芯片技术(biochiptechnique)是通过缩微技术,根据分子间特异性地相互作用的原理,将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。因此,生物芯片技术具有高通量、微型化、自动化、成本低、防污染等特点。按照芯片上固化的生物材料的不同,可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。自1998年,Kononen和kalloiniemi建立了组织芯片(TMAs)技术以来,组织芯片已经成为病理组织基础研究中的重要工具,主要应用于肿瘤研究。在组织芯片技术中,几十至上千不同肿瘤组织样本被排列在同一石蜡块上,将分子靶点(DNA、RNA或蛋白质)作为探针,应用免疫组织化学、荧光原位杂交或其他分子检测技术来分析TMA,从而获得高通量的原位分析,实验中既节省试剂,又能保证条件的一致性并减少不同批次间的误差。而且,多种不同组织芯片的组合可以快速全面描述有意义的生物标志物。基因芯片技术已用于生命科学研究的各个领域,在基础研究方面可用于基因表达谱分析、基因分型、基因突变和基因组的多态性的检测、新基因的寻找、遗传作图、重测序等。但目前还不适用于FFPE标本,且费用昂贵、实际操作困难,只能局限于实验室,难以广泛应用临床病理。但是随着生物技术的进步和发展,通过设计不同的探针阵列和使用特定的分析法等方法不断的发展和改进基因芯片技术,相信不久基因芯片技术将具有更广阔的应用前景。八、病理学的发展:新技术