肉蓉对快速老化骨质疏松小鼠血清骨钙素、骨密度及软骨形成蛋白2的影响

肉蓉对快速老化骨质疏松小鼠血清骨钙素、骨密度及软骨形成蛋白2的影响

骨质疏松症是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征的系统性骨代谢性疾病，容易发生骨代谢性疾病。骨质疏松症现已成为危害我国人口公共健康最严重的问题之一。根据中医“肾主骨”理论及中药现代药理研究,选择具有补肾阳、益精血、润肠通便作用的荒漠肉苁蓉,以快速老化骨质疏松小鼠(SMP6)为模型,验证荒漠肉苁蓉治疗老年性骨质疏松的有效性,探讨其干预的靶点及作用机理,为临床应用提供依据。1数据和方法1.1实验动物中心提供6月龄雄性SAMP6品系小鼠共40只,均由天津中医药大学第一附属医院实验动物中心提供(批号:津实动质M准字第006号,清洁级)。1.2电解保持微沸状态肉苁蓉水煎剂制备,称量肉苁蓉饮片125g,置于砂锅中,加入3L纯水,电炉加热保持微沸状态2h,收集滤液。为了充分提取肉苁蓉饮片中的有效成分,收集滤渣并加3L纯水再次煎煮,如此反复2次;合并滤液,置于旋转蒸发仪中真空浓缩至生药浓度为0.5g·mL-1肉苁蓉水煎剂母液,温度60~70℃。1.3骨密度测量和双能x线骨密度测量、骨形成发生蛋白2BGP放免与血清骨钙素放免试剂盒(美国METRA公司提供),双能X线骨密度测量仪(EXPERT-XL型,美国Lunar公司生产),骨形成发生蛋白2(全蛋白提取试剂盒,凯基公司生产,货号:KGP250)。1.4实验方法1.4.1各组大鼠血清中as6的水平6月龄雄性SAMP6品系小鼠共40只,分为4组:SAMP6肉苁蓉高浓度组,SAMP6肉苁蓉低浓度组,SAMP6鲑鱼降钙素组,SAMP6空白对照组。每组各10只,饲养在完全相同的条件下,自由采食饮水。1.4.2外施肉丽水煎剂、鱼降钙素组(1)肉苁蓉高剂量组,给药剂量为临床用药量的2倍,灌胃剂量为3.2g·kg-1的肉苁蓉水煎剂(生药浓度为0.2g·mL-1),每日灌胃1次,连续28d。(2)肉苁蓉低剂量组,给药剂量为临床用药量的0.5倍,灌胃剂量为0.8g·kg-1的肉苁蓉水煎剂(生药浓度为0.05g·mL-1),每日灌胃1次,连续28d。(3)鲑鱼降钙素组,推荐人体临床治疗量为50IU·d-1,依照人体常规剂量等效换算,给予SAMP6皮下注射鲑鱼降钙素5.6IU·d-1,连续28d。(4)空白对照组:给予相同的条件下,灌胃等体积蒸镏水,连续28d。其中小鼠用药剂量根据人和动物体表面积与剂量换算比计算所得。1.4.3小鼠血清中bgp的测定(1)血清骨钙素(BGP)含量测定:末次治疗结束后,各组小鼠禁食不禁水12h,摘眼球取血,分离血清,放免法测定BGP水平。(2)骨密度(BMD)的测定,连续28d治疗然后颈椎脱臼法处死小鼠,对其左后腿股骨用双能X线骨密度测量仪测骨密度。(3)BMP-2表达的测定,留取完整的右股骨段,并迅速投入液氮中,后转移至-80℃保存,用于提取蛋白;用裂解液超声提取总蛋白后,Westernblot法测定BMP-2表达。1.5统计方法采用SPSS17.0统计软件,计量资料以ue0af±s表示,多组间比较用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意思。2各组小鼠血清bgp、bmp-2的比较4组治疗后右股骨BMD、血清BGP、右股骨BMP-2含量变化比较,见表1。肉苁蓉高剂量组、肉苁蓉低剂量组和鲑鱼降钙素组的后右股骨BMD均高于空白对照组(P<0.05);肉苁蓉高剂量组的血清BGP低于肉苁蓉低剂量组(P<0.05);肉苁蓉高剂量组、肉苁蓉低剂量组和鲑鱼降钙素组的右股骨BMP-2均明显高于空白对照组(P<0.05);肉苁蓉高剂量组和鲑鱼降钙素组治疗后右股骨BMP-2的比较差异有统计学意义。3漠肉丽治疗冠心病的临床价值骨质疏松症常见于老年人。有资料显示,全世界有超过2亿人患有骨质疏松症,其发病率已跃居世界各种常见疾病的第7位。骨质疏松症祖国医学中归属于骨痿、骨痹、肾虚等范畴。如《内经》曰:“肾者主骨生髓”,《素问·痿论》曰:“肾气热,则腰脊不能举,骨枯而髓减,发为骨痿。”这些论述说明了肾与骨之间的关系,以及肾衰后引起骨的衰退,并出现一系列的症状。中医认为肾为先天之本,主骨生髓,肾中精气充足则骨髓生化有源,骨骼得到骨髓的滋养才能坚固有力;肾中精气亏乏则骨失所养,骨骼由强变弱,由弱变痿,故肾精不足失于养骨是骨质疏松发病关键。所以补肾类中药可以治疗骨痿、骨痹、肾虚等病。由此我们选择具有补肾阳、益精血、润肠通便作用的荒漠肉苁蓉治疗本病。因为肉苁蓉甘而微温,咸而质润,其性温而不热,暖而不燥,滑而不泄,滋而不腻。功善温补肾阳以补虚,润肠通腑治便秘,因其补而不峻,作用平和,故有苁蓉(从容)之意,尤其适用于老年病人。肉苁蓉的主要活性成分为苯乙醇苷类化合物,其中松果菊苷、毛蕊花糖苷是苯乙醇苷的两种单体化合物,它们具有激活肾上腺、释放皮质激素的作用,具有雄性激素样作用。苯乙醇苷对环磷酰胺所致小鼠生精障碍具有明显的治疗作用,其机制可能与改善睾丸组织中睾酮水平有关。另外,药理试验证明其水煎液有提高骨密度的功效。以上原因为选用肉苁蓉治疗骨质疏松症提供依据。SAMP62月龄即出现骨密度、股骨重量、股骨钙、磷含量较正常老化小鼠(SAMRl)相比显著下降,腰椎和股骨远侧干骺端小梁骨数量显著减少等现象。研究证实,培养不同月龄SAMP6股骨和胫骨的骨髓细胞后发现,SAMP6骨髓中前成骨细胞数量较SAMRl减少,且成骨潜能低下,BGP被广泛用于评价骨转换,反映了骨代谢的实时变化,其水平与骨组织形态学测定结果高度一致。SAMP6小鼠血清BGP水平较SMR1明显升高,因此提示SAMP6小鼠伴随衰老有成骨能力下降,破骨活跃,骨转换加剧的情况。本实验采用SAMP6小鼠能够较好的体现老年性骨质疏松症的病理变化,是研究OP的理想模型。骨质疏松症的发生主要与骨重建失衡引起的骨丢失密切相关。BMP-2是一种公认的成骨细胞转化促进因子,具有较强的促进骨形成的作用,在成骨细胞和成软骨细胞分化过程中,可以促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化,抑制其向其他细胞分化。近年来,许多学者也研究证明具有补肾作用的中药在治疗老年性骨质疏松症的研究中取得了较为满意的结果。通过对骨质疏松症中医研究的文献计量学分析,病机中肾虚频次最高,治则中补肾频次最高,肉苁蓉为常用中药。本研究选择具有补肾