化学品 非洲爪蟾胚胎甲状腺活性试验 征求意见稿

1GB/TXXXXX—XXXX化学品非洲爪蟾胚胎甲状腺活性试验警示——使用本文件的人员应有正规实验室工作的实际经验。本文件并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。本文件规定了化学品非洲爪蟾胚胎甲状腺活性试验的术语定义、受试物信息、参比物、试验原理、方法描述、试验程序、质量保证与质量控制、数据分析与试验结果评价。本文件适用于评价化学品对非洲爪蟾胚胎发育的内分泌干扰作用；适用于筛选具有潜在甲状腺活性的内分泌干扰化学物质或非甲状腺活性的化学物质。本文件不适用于高挥发性的化学物质；不适用于在非洲爪蟾胚胎中蓄积的化学物质；不适用于在波长450nm～500nm范围内激发时发射波长500nm～550nm范围荧光的化学物质。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T21801化学品快速生物降解性呼吸计量法试验GB/T21802化学品快速生物降解性改进的MITI试验（I）GB/T21803化学品快速生物降解性DOC消减试验GB/T21831化学品快速生物降解性密闭瓶法试验GB/T21845化学品水溶解度试验GB/T21852化学品分配系数（正辛醇-水）高效液相色谱法试验GB/T21853化学品分配系数（正辛醇-水）摇瓶法试验GB/T21855化学品与pH有关的水解作用试验GB/T21856化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验GB/T21857化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验GB/T22052用液体蒸汽压力计测定液体的蒸汽压力温度关系和初始分解温度的方法GB/T22228工业用化学品固体及液体的蒸汽压在10-1Pa至105Pa范围内的测定静态法GB/T22229工业用化学品固体及液体的蒸汽压在10-3Pa至1Pa范围内的测定蒸汽压平衡法GB/T27850化学品快速生物降解性通则GB/T27861化学品鱼类急性毒性试验OECD化学品测试导则No.104OECD化学品测试导则No.231OECD化学品测试导则No.241DevelopmentAssay）蒸气压（Vapourpressure）两栖动物变态试验（AmphibianMetamorphosisAssay）两栖动物幼虫生长发育试验（TheLarvalAmphibianGrowthand2GB/TXXXXX—XXXXOECD化学品测试导则No.310快速生物降解—密闭瓶二氧化碳法（ReadyBiodegradability-CO2inSealedVessels）OECD化学品测试导则No.316化学品在水中的光转化—直接光解试验（PhototransformationofChemicalsinWater–DirectPhotolysis）3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1胚胎eleutheroembryo胚胎生命阶段是指卵孵化后、但在胚胎能独立进食外源性食物之前的阶段，是胚胎正在发育的阶段。3.2GFPgreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白。3.3半数致死浓度medianlethalconcentration;LC50经口单次暴露，经过统计计算得出的受试物的浓度，该浓度能引起50%的受试动物死亡。3.4最低可见效应浓度thelowestobservedeffectconcentration;LOEC观察到受试物具有统计学显著效应的最低试验浓度(p<0.05)。3.5MS-222tricainemethanesulfonate三卡因甲磺酸酯，CAS编号：886-86-2。3.6最大耐受浓度maximumtoleratedconcentration;MTC导致急性死亡率低于10%的最高试验浓度。3.7无明显作用浓度thenoobservedeffectconcentration;NOEC未观察到作用的浓度,是紧邻LOEC以下的试验浓度。3.8PTUpropylthiouracil丙硫氧嘧啶。3.9SEMstandarderrorofthemean3GB/TXXXXX—XXXX平均值的标准差。3.10SMILESsimplifiedmolecularinputlineentryspecification简化分子输入行输入质量标准。3.11运行run本文件中指使用独立的溶液和非洲爪蟾卵执行的实验。3.12加标模式spikedmode在浓度为3.25µg/L三碘甲状腺原氨酸（T3的条件）下运行的非洲爪蟾胚胎甲状腺活性试验的部分。3.13未加标模式unspikedmode不存在三碘甲状腺原氨酸的条件下运行的非洲爪蟾胚胎甲状腺活性试验的部分。3.14T3triiodothyronine三碘甲状腺原氨酸。3.15T4thyroxine甲状腺素。3.16TRthyroidhormonereceptor甲状腺激素受体。3.17THthyroidhormones甲状腺激素，包括T3（三碘甲状腺原氨酸）和T4（甲状腺素）。3.18THb/ZIP甲状腺激素β/ZIP转录因子。3.19UVCBthyroidhormones未知或可变组成的物质、复合反应产物或生物材料。4受试物信息4GB/TXXXXX—XXXX4.1在试验前，应掌握受试物的下列必备信息：a)按照GB/T21845的规定方法测定的水中溶解度；b)按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229的规定和见OECD化学品测试导则No.104的方法测定的蒸气压和亨利常数。4.2可能需要受试物的下列信息：a)结构式；b)纯度；c)受试物在水溶液中的定量分析方法；d)按照GB/T21855的方法测定的水解作用；e)按照OECD化学品测试导则No.316的方法测定的光稳定性；f)按照GB/T21852或GB/T21853的方法测定的正辛醇-水分配系数；g)按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T21856、GB/T21857、GB/T27850的规定和见OECD化学品测试导则No.310的方法测定的快速生物降解性试验结果；h)按照GB/T27861的方法测定的鱼类的LC50数据；i)按照OECD化学品测试导则No.231、No.241的方法测定的其他两栖动物的数据。4.3测定4.1和4.2中参数的温度，应在试验报告中予以说明。5参比物本试验方法采用三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）为参比物。6试验原理将6孔板中处于NF45阶段转基因THb/ZIPGFP非洲爪蟾（X.laevis）胚胎（以下简称“胚胎”）分别置于含有3.25µg/L的T3“加标模式”和不含有T3的“未加标模式”中。持续暴露于受试物72h。每项试验应独立进行三次。通过荧光光谱或荧光成像（将荧光信号转换为数值形式）测量胚胎发出的GFP荧光。统计分析在加标和未加标模式下，每个受试物浓度组相比各自对照组胚胎发出的荧光增加或减少的百分比，判断受试物是否具有甲状腺活性。7方法描述7.1试验条件附录A列出具体的试验条件。7.2对照组7.2.1本试验设置以下对照组。a)试验培养液对照组：仅加入试验培养液的2孔（每孔10个胚胎）。该对照组确定了试验培养液中的基础荧光水平。5试验培养液对照组T3对照组T4对照组受试物：3个浓度+/-T3每组20试验培养液对照组T3对照组T4对照组受试物：3个浓度+/-T3每组20个胚胎试验培养液对照组T3对照组T4对照组受试物：3个浓度+/-T3每组20个胚胎3个有效的独立运行：不同的卵，不同的溶液XETA原始数据b)T3对照组：该对照组确定了T3浓度为3.25µg/L时的荧光水平。该浓度相当于非洲爪蟾变态期间的血浆T3激素浓度，是已知能诱导变态前胚胎的形态变化和TH靶基因调控的浓度。该对照组用作无T3共同处理组的阳性对照组和接受T3共同处理组的参比对照。c)T4对照组（饱和对照组）：该对照组确立了实验中可定量测量的最大荧光水平。该对照作为T3共处理组的阳性对照，与试验培养液对照组一起确定了实验的荧光动态范围。7.2.2如果使用溶剂，应在试验培养液对照组、T3对照组和T4对照组中加入相同浓度的溶剂（见7.10）。7.3重复次数1项试验由3次独立、有效的运行组成，每个处理组使用2×10个胚胎（见图1）。每次运行应使用独立的溶液和卵（见第37段）。3次运行可依次进行，也可平行进行。通过合并三次运行的数据得到每个处理组n=60的荧光值，获得受试物的原始数据。试验培养液对照组T3对照组T4对照组受试物：3个浓度+/-T3每组20个胚胎将每组20个荧光值合并为每组60个值试验培养液对照组T3对照组T4对照组受试物：3个浓度+/-T3每组60个胚胎检查有效性进行统计分析图1方法概述注：本试验由3次独立运行组成，共使用540个胚胎。如果之前未对溶剂进行本试验且结果显示为阴性（需要增加120个胚胎），则除试验培养液对照组和T3对照组外，应在每次运行中设置一个溶剂对照组和一个T3溶剂对照7.4熟练程度证明7.4.1荧光定量测量预实验为确保对每个胚胎发出的荧光进行准确的定量测量，应通过预实验校准荧光光谱仪，详见附录B。也可使用配有适当照相机的荧光显微镜成像，对胚胎发出的荧光进行定量测量。在这种情况下，使用T3浓度范围获得的荧光诱导幅度应符合与荧光光谱仪相同的标准；宜使用与附录B中荧光光谱仪相同的程序优化图像采集和图像分析参数。宜使用配有适当摄像头的荧光显微镜，因为这样可对图片执行质量控6GB/TXXXXX—XXXX制步骤，以识别错位的胚胎或与甲状腺激活无关的荧光信号（荧光灰尘或纤维、胚胎中蓄积的受试物荧光、异常荧光模式）。7.4.2能力验证化学品在正式使用本试验方法测受试物之前，实验室应对表1中列出的四种能力验证化学品进行本试验，通过得到正确的分类结果来证明技术熟练度。表1能力验证化学品67-64-17.5仪器设备除常规实验室仪器设备外，还需要以下设备：a)实验室培养箱或适当的温度和光照控制装置；b)由化学惰性材料制成的透明细胞培养级6孔板；c)经荧光定量测量确认的圆锥形、底部黑色的96孔板；d)pH计；e)配备光源的体视显微镜（用于观察和分选胚胎）；f)荧光光谱仪（96孔酶标仪）或配备用于GFP荧光定量测量的荧光显微镜；g)适用于受试物的分析仪器。7.6受试生物采用THb/ZIP-GFP转基因细胞系的杂合子非洲爪蟾（X.laevis）胚胎作为受试生物。这些胚胎应由纯合子TH/bZIP-GFP非洲爪蟾与野生型非洲爪蟾交配产生。用作受试生物的所有胚胎应来自相同批次的受精卵。每一个批次的受精卵都应由同一只雄性和同一只雌性繁殖。7.7试验培养液试验培养液可选适合非洲爪蟾正常生长和发育的水，包括玻璃瓶装矿泉水、泉水、井水和活性炭过滤自来水。应进行水质分析，以筛查可能干扰检测的潜在污染物（包括重金属）和化学品。应特别注意铜、氯和氯胺，这些物质对胚胎均有毒性。应报告水质分析结果。适用于非洲爪蟾的试验培养液的一些化学特性见附录F。7.8测量受试物的潜在荧光将在本试验中预期的最高浓度受试物溶液200µL和200µL试验培养液，分别置于96孔板的两个孔中，并使用与胚胎荧光相同的定量装置和设置对荧光进行定量测量。如果识别出荧光化学物质，20例野7GB/TXXXXX—XXXX生型非洲爪蟾胚胎应在21℃条件下暴露72h，每天更新至预期在本试验中的最高浓度，应定量测定，并与仅在相同条件下暴露于试验培养液的一组20个野生型非洲爪蟾胚胎激发的荧光进行比较。7.9试验浓度7.9.1确立最大试验浓度通过受试物在试验培养液中的溶解度限度、最大耐受浓度（MTC）、诱导胚胎畸形的最大浓度小于10%或最大浓度为100mg/L（以最低值为准）设定。如可获得其他水生生物毒性试验的数据（例如，鱼类的LC50，或鱼类胚胎、QSAR数据或交叉参照法的可能性，或其他两栖动物物种的数据），可通过专家判断来确定最大试验浓度。如相关的急性毒性数据不可用，在进行正式试验之前，实验室应对胚胎进行预试验，探索试验浓度范围，以评价可能的毒性。预试验应包括至少2个试验浓度，包括选定的最高试验浓度或估计的MTC。测定的最高浓度的急性死亡率应在10%以上。7.9.2试验浓度设置至少需要3个试验浓度和1个试验培养液对照组（必要时设置溶剂对照组）。宜用3倍～10倍的浓度间距系数。7.10配制受试物溶液通常通过稀释贮备液制备选定浓度的受试物溶液。应将各受试物溶液的pH值调节至6.5～8.5。应通过搅拌、搅拌或超声等机械方法或其他适当方法将受试物溶解于试验培养液中制备贮备液。不宜使用溶剂。如果需要溶剂来制备适当浓度且均匀的贮备液，则贮备液中溶剂的最高浓度应至少低于无明显作用浓度（NOEC）一个数量级，并且在任何情况下都不应超过100μL/L或100mg/L。如果使用溶剂，所有试验组和对照组都应加入相同浓度的溶剂。如果之前未对溶剂使用本方法进行试验，且显示为阴性，则应同时进行溶剂对照和试验培养液对照以及T3对照和T3溶剂对照试验。宜在预试验中，根据受试物的理化性质和非洲爪蟾的敏感性选择合适的溶剂。可使用二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、甲醇、丙酮、乙腈。注：尽管可用DMSO，但不应优先使用，因为其增加了8试验程序8.1暴露条件将作为受试生物的胚胎置于由惰性材料制成的细胞培养级6孔板（通常孔的内径为34mm、高度为20mm）。每个孔加入8mL溶液、10个胚胎。在一次试验中，每个试验浓度使用20个胚胎。每个对照组含20个胚胎（见7.2）。如果塑料孔板不适合给定的受试物，则应使用玻璃容器（即小直径培养皿）替。在整个试验期间，将胚胎置于黑暗、21℃±1℃的培养箱中培养72h±2h。8.2分析测定采用半静态更新方法，应记录受试物浓度的稳定性。在24h内，受试物浓度的变化不宜超过配制浓度的20%。应至少在试验开始时、首个更新周期结束时（试验培养液更新前后）和试验结束时分析最高和最低试验浓度。可接受的最长更新周期是24h±2h。如果试验系统中受试物的浓度不能维持在±20%范围内，则可考虑缩短更新时间和/或在开始前用试验培养液预处理试验容器24h，以将吸附导致的受试物损失降至最低。对于不在配制浓度80%～120%范围内的受试物，可使用平均测定浓度。8GB/TXXXXX—XXXX8.3试验开始和进行8.3.1第0d应在胚胎发育至NF45阶段时开始暴露（21℃条件下受精后7d；见附录C）。每次运行应使用同一个非洲爪蟾的卵进行。由于每次试验运行三次，因此每次试验应使用三批卵。每次运行使用的所有胚胎均应来自同一雌蟾同一次生殖（即，不同雌蟾产的卵不应混合）。应在双目解剖显微镜下观察胚胎，并将显示肉眼可见畸形、异常色素沉着或身体损伤（例如，尾部损伤、水肿、脊柱侧凸）的胚胎从试验中排除（见附录G和附录H）。应将原种群的健康且外观正常的胚胎合并到一个含有适当体积试验培养液的容器中。所选胚胎应大小均匀，应剔除过大和过小的胚胎。在NF45阶段正常和健康胚胎少于80%的非洲爪蟾产的卵不应用于试验。对于发育阶段测定，应使用移液管从合并的容器中取出胚胎，并在透明培养皿中分散至一滴稀释水中。对于阶段确定，不宜使用麻醉剂。如果使用了麻醉剂，例如MS-222（三卡因甲磺酸酯），应从有经验的实验室获得适当使用方法，并与试验结果一起报告。通常情况下，使用0.1g/L的MS222，并调节pH值至7～8。如果对胚胎进行麻醉，应在相同条件下对三次运行中使用的所有胚胎进行麻醉。在此转移过程中，应小心处理胚胎，以尽量减少操作压力并避免任何损伤。通过显微镜或适当的数字成像确定发育阶段。将10个胚胎/孔放入6孔板的试验培养液液滴中（使用移液管，切掉枪头，以避免损伤胚胎）。应除去试验培养液，首次加入受试物溶液。应注意一次使用一个培养板，以避免胚胎干燥。6孔板设置示例见附录I。8.3.2第1d和第2d受试物溶液和对照组溶液应在24h和48h±2h更换。检查各孔是否存在外观异常的胚胎（损伤、异常游泳行为等）。应清除死亡胚胎或显示肉眼可见畸形（附录G）或受伤的胚胎，并按8.4对畸形或受伤的胚胎实施安乐死。应记录所有观察结果。8.3.3第3d荧光定量测量暴露72h±2h后，定量测量每个胚胎的荧光。胚胎应单独移（即每孔一个胚胎）至黑色96孔板的孔中。应先用8mL试验培养液更新试验培养液，并除去死亡的胚胎或肉眼可见畸形的胚胎。应记录所有观察结果。如果在一个对照组或一个给药组中发现累积死亡率>10%或累积畸形率>10%，且试验浓度不足3个，应停止正在进行的独立运行，并确定死亡或异常的来源。然后向孔中加入2mL浓度为1g/L缓冲液MS222，麻醉胚胎。为避免过度麻醉，仅麻醉一次填充一个96孔板所需的胚胎数量。全麻醉后（2min~5min将胚胎分别置于96孔板的每个孔中。建议将来自6孔板同一孔的胚胎置于96孔板的同一行（即96孔板每行相当于6孔板的一个孔）。96孔板示例见附录J。每个胚胎体都用一个细的移液管放在背上（来回抽吸培养液将有助于转动移除大部分培养液，同时在胚胎体下维持足够的水分。将胚胎分别置于孔中，头部位于孔中心，背面与孔底部接触。尾巴放在胚胎头部周围（正确定位的图像如附录K所示）。然后将含有胚胎的96孔板放入荧光光谱或荧光显微镜下，使用校准期间识别的参数定量测量荧光。注：一旦将胚胎背部朝下放置在微孔底部并去除MS222，为了防止胚胎变干，快速进行荧光定量测量非常重要。如果使用荧光光谱代替荧光显微镜对信号进行定量，则存在无法评估异常荧光模式（8.4试验终止读取荧光测量值后，使用挤压瓶将96孔板的每个孔灌满MS222(1g/L)缓冲溶液，使胚胎安乐死。按照当地实验室安全管理的要求处理96孔板。9质量保证与质量控制9GB/TXXXXX—XXXX在试验结束时满足以下条件，试验结果有效：a)应测量试验培养液对照组和T3对照组之间的荧光诱导具有统计学显著性。T3对照组的平均荧光值应至少比试验培养液对照组的平均荧光值高20%；b)T4对照组和试验培养液对照组的荧光诱导之间应具有至少70%的统计学显著性；c)测定试验培养液对照组荧光强度的变异系数应不超过30%；d)每次更新时，暴露溶液的初始pH值应在6.5～8.5之间；e)各对照组胚胎的死亡率不超过10%；f)各对照组中畸形胚胎的百分比不应超过10%。10数据分析与试验结果评价10.1数据分析注意事项在对数据进行分析之前，应从数据中删除已知为空的孔的荧光测量值。在统计分析之前，可通过省略在每次运行中每个对照组和每组T3加标和未加标试验浓度的最高和最低10%的荧光值（即省略每组20个值的两个最高值和两个最低值）进行修剪。该微调旨在从多个事件中删除XETA中出现的数值，包括错误分类的胚胎（异常大小或色素沉着）、96孔板中错误放置的胚胎（倒置或侧向放置）、麻醉后死亡的胚胎和不含胚胎的孔。或者，如果使用荧光显微镜进行荧光定量测量，在进行统计分析之前，应使用图像质量控制代替10%修剪，以去除与这些事件对应的值。如适用，应说明图像质量控制后从分析中移除的图像数量。将3次独立运行的数据合并，以获得各浓度和对照组的42个（最差情况）至60个荧光值。如果首次在试验中使用了溶剂，应通过比较溶剂对照组和试验培养液对照组的统计学差异来评价溶剂的潜在影响。如果试验培养液对照和溶剂对照组之间无统计学显著性差异，则应使用合并的试验培养液和溶剂对照组。对于三次运行的合并液，如果检测到试验培养液对照组和溶剂对照组之间的统计学显著性差异大于12%，表明试验受到影响。考虑单独运行，以确定溶剂在三次运行中是否具有可复现效应。如果是，表明试验受到影响，应考虑使用新批次溶剂或其他溶剂重新进行试验。如果仅有一次或两次运行受到影响，则应考虑变更溶剂批次，进行新的运行。10.2统计分析采用单侧假设检验(p<0.05)研究了与对照组相比对受试物荧光的影响。宜进行逐步下降趋势检验，以确定对照组和不同受试物浓度之间是否存在显著差异(p<0.05)。应使用Williams检验或Dunnett检验进行比较，以确定任何统计学差异（可行的统计分析方法见附录10.3判定逻辑为本试验方法开发了判定逻辑，以在测定结果的执行和解释中提供逻辑帮助（见图2中的流程图）。该判定逻辑基于汇总用于统计分析的3次有效运行（见图1）。如果在T3加标和/或未加标模式下，至少一个试验浓度（包括最高浓度）具有活性，则认为受试物的试验结果为阳性。a)在未加标模式下，活性浓度定义为相对于受试物培养液对照组具有统计学显著性荧光增加幅度不小于12%的浓度。b)在T3加标模式下，活性浓度定义为相对于T3对照组，具有统计学显著性的荧光增加或降低幅度不小于12%的浓度。否是是是考虑其他试验方法是有甲状腺活性是有甲状腺活性GB/TXXXXX—XXXX否是是是考虑其他试验方法是有甲状腺活性是有甲状腺活性c)根据把握度分析确定12%阈值，发现所有浓度-响应模拟形状的把握度均超过80%。两个验证阶段的结果确认了该阈值的充分性，结果表明，使用非活性参比物处理的胚胎组没有超过12%的统计学显著变化。受试物激发荧光在GFP波长范围内且有生物蓄积性否进行XETA试验，合并三个有效的运行且进行统计分析有效有效是在未加标模式下统计学显著的荧光降低>12%否重复XETA试验考虑用更低浓度重复XETA试验，或进行其他试验在未加标模式下观察到至少一个试验浓度且包括最高试验浓度，具有统计学显著性的荧光增加>12%否在加标模式下观察到至少一个试验浓度且光增加或降低>12%否在加标模式下观察到至少一个试验浓度不包括最高试验浓度；或在加标或不加标模式下缺少与浓度相关的效应变化，具有统计学显著性的荧光增加或降低>12%检查3个独立运行的剂性，并考虑改变浓度范围重复XETA试验否XETAXETA试验结果无甲状腺活性图2解释试验结果的判定逻辑如果发现多个试验浓度具有活性，但不遵循浓度-响应关系，或者如果发现一个或多个试验浓度具有活性，但最高试验浓度不具有活性，应通过比较三次运行的结果确认该结果的复现性。如果结果不可复现，则应采用另一个剂量范围重复试验，以确认结果（见图2的流程图）。如果结果可复现，则认为受试物具有甲状腺活性。预计在未加标模式下不会出现荧光下降，因为在此发育阶段，胚胎不合成其自身的TH。如果在未加标模式下观察到统计学显著的荧光下降>12%，则表明受试物通过与甲状腺无关的方式减少了GFP的合GB/TXXXXX—XXXX成，本试验方法不适用于该受试物，或者是所用胚胎或试验条件的潜在问题，需要进一步研究。应考虑单独运行，以确定三次运行中是否存在统计学显著性荧光下降，然后使用最佳专业判断来决定按哪种方式重复：仅使用一批新胚胎进行一次运行；或使用较低浓度范围的完整试验；或进行其他的甲状腺活性试验。10.4试验报告试验报告应包括以下内容：a)受试物和参比物：.单一组分的物质：物理状态、水溶解性及相关的物理化学特性；化学标识，如IUPAC名称或CAS名称、CAS号、SMILES号或InChI号、通用名、结构式、纯度、杂质含量以及实用的信息（如有机碳含量，如适用）；生物降解信息（如可用）；.多组分的物质、UVCBs（成分未知或组分多变、复杂反应产物或生物材料）和混合物：通过化学鉴别获得尽可能多的特性信息，各组分相关理化特性；.关于在450nm和500nm波长处无荧光发射的结果；以及关于在这些波长范围有荧光的物质在胚胎中无蓄积的结果。b)胚胎：.学名、转基因品系、供应商或来源、培养条件。c)试验条件：.试验培养液特性的详细信息（矿泉水或泉水的参考资料，自来水处理的描述。例如，活性炭过滤）和进行的任何测定；.贮备液的制备方法和更新频率（使用时应给出溶剂及其浓度）；.用于暴露和荧光定量测量的6孔板和96孔板的品牌和参考资料；.用于定量测量的荧光光谱或荧光显微镜的参考资料和设置。对于后一种情况，还应提供用于图像分析的方法。d)试验结果：50或MTC的任何初步研究结果；.配制试验浓度和所有化学分析结果，以确定试验容器中受试物的浓度；测定的暴露浓度作为适当的统计平均值（例如算术平均值、时间加权平均值等）如适用；还应报告分析方法的回收率和定量限；.每次运行中死亡和畸形胚胎的数量及其发生日期；.荧光定量测量的原始数据（例如，单个荧光原始数据）；.数据的统计分析和处理方法，包括使用的统计检验以及是否和为什么进行任何数据收集。.所有组胚胎的存活和畸形均符合有效性标准的证据；.每个实验组的荧光平均值，包括所有对照组和受试物浓度及其SEM（平均值的标准误差）均应通过图形表示和表格呈现；.在加标和未加标模式下，每个浓度的荧光测量值相对于各自对照组的荧光测量值增加或减少百分比；.在适当情况下，溶剂潜在影响的评价结果：溶剂对照组和试验培养液对照组的统计学比较（如果纳入本研究）或既往研究显示XETA中溶剂为阴性的结果；GB/TXXXXX—XXXX.其他观察或检测到的生物学效应：报告观察到或检测到的任何其他生物学效应（例如，异常行为、畸形或异常色素沉着）；.对本试验方法偏离或验收标准偏离的解释，以及对试验结果潜在后果的考虑；.在适当情况下，对加标和未加标模式下发现的活性浓度列表进行讨论；.提供本试验中受试物是否具有甲状腺活性或无活性的结论。GB/TXXXXX—XXXXA（资料性）试验条件概述表A.1试验条件概述允许X.laevis正常生长和发育的水（参见第23段）），pH6.5～8.5，所有对照组死亡率≤10%，所有对照组畸形≤10%GB/TXXXXX—XXXX（资料性）校准：最佳荧光光谱设置的确定B.1校准目标校准的目标是确保在简单条件下使用设备可达到最佳响应幅度。在测试受试物之前，确保荧光读取器允许使用T3获得适当的动态浓度响应。B.2校准的步骤校准需要两个步骤：a)寻找荧光光谱的最佳设置，以在T3浓度为3.25µg/L时，获得令人满意的GFP诱导幅度；b)将这些设置应用于T3的三个浓度响应实验的定量测量，以检查使用逐渐增加的T3浓度的诱导幅度和引起可检测到GFP响应可检测浓度的最低T3浓度的诱导幅度。B.3寻找荧光光谱的最佳设置B.3.1开始实验前开始实验前需要：a)确定可在所选荧光光谱仪型号上设置的参数；b)根据实验室间确认期间使用的设置组合选择一个首选组合或/和之前使用所选荧光光谱仪进行的任何实验。考虑到设置应导致96孔板读数时间小于30min；c)确定要首先优化的参数。B.3.2制备T3贮备液和T4贮备液B.3.2.1制备T3（6.51g/L）贮备液。a)该贮备液可在-20℃条件下储存1年。b)称取100mgT3，置于称量皿中，轻轻倒入20mL容量瓶中。c)用4.47mL浓度为1mol/L氢氧化钠溶液冲洗称量盘，并轻轻加至20mL容量瓶中。d)用搅拌棒轻轻混合1小时；确保溶液澄清。e)移取4.1mL该溶液，置于新的20mL容量瓶中；加入9.9mL超纯水。f)用搅拌棒搅拌1小时。g)在0.5mL微量离心管中制备足量的30µL等分试样，放入冰柜储存。h)将剩余溶液放入多个1.5mL试管中。i)保存：-20℃保存1年。B.3.2.2制备T4（0.8g/L）贮备液。a)称取40mgT4，置于称量皿中，轻轻倒入50mL容量瓶中。b)用50mL超纯水冲洗称量盘，轻轻加入容量瓶中。GB/TXXXXX—XXXXc)加入0.1mL浓度为1mol/L的NaOH溶液。d)用搅拌棒轻轻混合1小时；确保溶液澄清。e)制备1mL等分试样，并在-20℃下最多储存6个月。B.3.3制备以下溶液a)暴露培养液将1L试验培养液置于1L玻璃瓶中。b)暴露培养液+T3（3.25µg/L）将1L试验培养液置于1L玻璃瓶中。加入1mL浓度为3.25mg/L的T3溶液。c)暴露培养液+T4（10mg/L）制备300mL浓度为10mg/L的T4溶液：1)将296.25mL试验培养液置于500mL瓶中；2)加入3.75mL浓度为0.8g/L的T4贮备液；3)通过摇瓶混合；4)4℃避光保存。B.3.4操作按照试验方法中的描述，暴露72h，包括5组20个对照组、5组T3对照组和5组T4对照组胚胎（6孔板中，每孔10个胚胎），每天更新。72h后，用MS-222麻醉胚胎，并将各胚胎置于96孔板的单独孔中，确保所有胚胎麻醉时间均不超过45min。用第一组参数设置的荧光光谱仪定量测荧光。通过适当调整设置（一次一个参数）优化荧光定量测量。同一胚胎麻醉时间不得超过45min。麻醉时间过长将导致胚胎死亡、荧光伪影。45min后继续校准，麻醉三组新胚胎并加载新的96孔板。采集数据后，计算各组平均荧光值和变异系数(CV)。按公式（B.1）计算T3组荧光诱导百分率：RFUT3=（mRFUT3-mRFUC）×100%/mRFUC…（B.1）式中：RFU——相对荧光单位；RFUT3——按相对荧光单位计算的T3组诱导百分比；mRFUT3——按相对荧光单位计算的T3组平均荧光值；mRFUC——按相对荧光单位计算的对照组平均荧光值。按公式（B.2）计算T4组荧光诱导百分率：RFUT4=（mRFUT4-mRFUC）×100%/mRFUC…（B.2）式中：RFUT4——按相对荧光单位计算的T4组诱导百分比；mRFUT4——按相对荧光单位计算的T4组平均荧光值；mRFUC——按相对荧光单位计算的对照组平均荧光值。B.3.5每个参数应优化为GB/TXXXXX—XXXXa)获得对照组和T3对照组之间以及T3对照组和T4对照组之间的荧光诱导，接近验证期间观察到的荧光诱导。b)对照组和T3对照组之间的荧光诱导范围为30%～75%，平均值为45%。c)对照组和T4对照组之间的荧光诱导范围为70%～190%，平均值为105%。d)确保T4对照组未达到荧光光谱仪饱和度。e)96孔板的总读取时间小于30min，宜为20min。B.4使用递增浓度的T3测定荧光诱导幅度和LOECB.4.1改试验应用三批独立的卵重复三次。试验浓度分别为：0mg/L（未处理对照组）、26µg/L、13µg/L、6.5µg/L、3.25µg/L、2µg/L、1.5µg/L、1µg/L、0.65µg/L。B.4.2溶液制备B.4.2.1从-20℃下取出一等份浓度为6.51g/L(10-2mol/L)的T3贮备液，先制备浓度为0.65g/L的T3中间溶液，然后制备浓度为3.25mg/L的T3溶液。a）制备浓度为0.65g/L的T3中间溶液250µL：1）将225µL试验培养液置于1.5mL移液枪中；2）加入25µL6.51g/L的T3溶液；3）搅匀。b)制备浓度为3.25mg/L的T3溶液20mL：1)将19.9mL试验培养液置于50mL试管中；2)加入100µL浓度为0.65g/L的T3溶液；3)搅匀。B.4.2.2按表B.1制备相应浓度的T3试验溶液。表B.1T3试验溶液的制备2T3_1165mLT3_1将稀释液在4℃下避光贮存。使用稀释液进行暴露和两次更新。B.4.2.3如下操作制备T4溶液a)将60mL试验培养液置于100mL瓶中。b)取出并丢弃0.75mL。c)加入0.75mL浓度为0.8g/L的T4贮备液。d)搅拌混合液。e)4℃避光储存。GB/TXXXXX—XXXXB.4.3暴露和更新B.4.3.1暴露按照B.4.2.2描述制备T3试验溶液。a)用切掉吸头的塑料移液管（避免损伤胚胎）将分选好的胚胎放入6孔板的试验培养液中，每孔10个胚胎（注意仅包括外观健康、大小和着色均一的胚胎）。b)使用塑料移液管小心吸取试验培养液，开始暴露。用8mL适当溶液替换试验培养液。B.4.3.2更新在24h和48±1h更换试验培养液。a)从冰箱中取出相关贮备液，并在21℃±1℃下放置至少1小时，然后进行更新。b)取出任何死亡或异常的胚胎。c)用3mL移液器小心吸取约90%培养液。d)用8mL适当的更新溶液灌装各孔。e)将微孔板置于21℃±1℃黑暗培养箱中。B.4.4测量荧光72h±2h后，按照试验方法中所述麻醉并将胚胎置于96孔板中，并测量荧光。按照试验方法中的描述进行数据处理和统计分析，以获得LOEC。B.5解释结果对于上述实验，结果应显示：a)对照组和T3对照组之间以及T3对照组和T4对照组之间的荧光诱导与验证期间观察到的荧光诱导接近（见B.3.5）；b)在T4对照组中，荧光光谱仪从未达到饱和；c)T3的LOEC应为3.25µg/L或更低。如果结果不符合这三点，则应改进荧光光谱仪设置。GB/TXXXXX—XXXX（资料性）NF45和NF47期胚胎C.1NF45期胚胎图C.1NF45期胚胎背视图图C.2NF45期胚胎腹视图图C.3NF45期胚胎侧视图GB/TXXXXX—XXXX图C.4绘制的NF45期胚胎腹视图C.2NF47期胚胎在NF47阶段，胚胎的肠螺旋达到2.5圈到3.5圈，腹部出现黄色素细胞，后肢芽明显。图C.5显示腹部出现黄色素细胞，图C.6显示肠螺旋。图C.5NF47期胚胎侧视图图C.6NF47期胚胎腹视图图C.7绘制的NF47期胚胎侧视图图C.8绘制的NF47期胚胎腹视图GB/TXXXXX—XXXX（资料性）接收胚胎：驯化和批次验收D.1接收胚胎胚胎应在试验开始前3天内接受，以进行适当恢复和适应。仅当从接收批次至开始暴露之间出现的死胚或异常胚胎少于20%时，方可接受该批次。D.2试验开始前3天接收胚胎的指南a)不要混合来自不同非洲爪蟾卵的胚胎。b)对胚胎进行分选以除去死亡和异常胚胎，这些胚胎的比例应小于20%，否则该批次不应用于试验。c)仅将同一蟾卵的存活胚胎和正常健康胚胎转移到含有试验培养液的10L水族箱中。d)每10L水族箱的最大密度是800个胚胎。e)在21℃±1℃（避光）条件下孵育胚胎。f)上述步骤后，实验开始前不得更新水族箱中的培养液。GB/TXXXXX—XXXX（资料性）E.1培育胚胎需要的材料包括：a)双目显微镜；b)漂白剂溶液(100%)；c)庆大霉素溶液；d)2%半胱氨酸溶液，pH值7.5～8；e)(des-gly,D-ala,pro-NHEt)亮氨酸释放激素醋酸盐（LHRH醋酸盐），-20℃储存;f)人绒毛膜促性腺激素(HCG)，4℃保存；g)0.1倍Marc改良林格氏（MMR）溶液+庆大霉素50µg/L；h)注射器，5mL和1mL；i)注射器针头（粉红色针头），G181½;j)注射器针头（橙色针头），G255/8；k)250mL烧杯，用于盛放卵（囊胚期）。E.2样品育种计划表E.1样品育种计划（实验开始前一周的星期一开始育种）星期一里），//E.3育种所需溶液的制备E.3.1制备MMR(20倍)贮备液2L将234g氯化钠、6g氯化钾、3.8g氯化镁、11.76g氯化钙、48gHEPES粉末置于2L玻璃瓶中，加入蒸馏水QSP2L，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.5～8，在4℃条件下至多储存2个月。GB/TXXXXX—XXXXE.3.2从MMR(20倍)贮备液制备0.1倍MMR溶液10L将50mLMMR(20倍)贮备液倒入10L容器中，用蒸馏水定容至10L，用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.5～8，使用期间室温储存（最多2星期）。E.3.3制备0.1倍MMR溶液+浓度为50µg/L的庆大霉素溶液取2mL浓度为50mg/L的庆大霉素溶液，置于2L容量瓶中，加入0.1倍MMR溶液至2L，用封口膜盖住容量瓶，翻转数次混合，使用期间室温储存（最多2星期）。E.3.4制备2%的半胱氨酸溶液（pH值7.5～8）称取2g半胱氨酸，加入0.1倍MMR溶液90mL。用10mol/L的NaOH溶液，随后用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至7.5～7.7。加入0.1倍MMR溶液至100mL，仅在使用当天制备。E.3.5制备促性腺激素释放激素GnRH（LHRH醋酸盐）溶液从-20℃冰柜中取出LHRH醋酸盐粉末(GnRH)试管，用720µL无菌水将5mg粉末直接重悬在试管中（得到浓度6.94µg/µL的贮备液）。在1mL无菌水中加入6µL贮备液，或者在15mL无菌水中加入90µL贮备液（需要较大体积时），得到最终浓度41.64µg/mL的溶液。在1.5mL无菌移液枪中去1mL等分试样。等分试样在-20℃贮存。E.3.6制备人绒毛膜促性腺激素(HCG)溶液采购一瓶5000单位的HCG粉末。用无菌注射器取0.9%的氯化钠溶液5mL，注入HCG瓶中，使浓度得到浓度为1个单位/µL的HCG溶液。手动搅拌混匀。未使用的溶液可在4℃条件下最多贮存2周。E.4育种程序E.4.1星期一：注射激素诱导雄性和雌性成年非洲爪蟾交配。E.4.1.1雄性非洲爪蟾可注射GnRH或HCG。E.用GnRH（LHRH醋酸盐）注射雄性非洲爪蟾1)：a)从-20℃冰柜中取出一等份GnRH(41.64µg/mL)，并在室温下解冻；b)为了减小痛苦，把非洲爪蟾蒙住眼睛固定；c)使用25号（橙色）针头和装有0.120mL解冻GnRH溶液的1mL注射器，进行背部皮下注射。为了确保注射量完全保留在爪蟾体内，应将注射针头平行于后肢上部插入皮下，然后在皮下穿过侧线器官到达背侧淋巴囊。然后进行注射，很容易看到注射可能在淋巴囊的皮肤下形成气泡。然后小心取出针头后，气泡将停留，直至通过淋巴系统吸收，注入液没有渗出，因为侧线系统紧贴下方的肌肉组织，从而防止注入液损失。E.用HCG注射雄性非洲爪蟾：a)使用1mL注射器和25号（橙色）针头，吸取10个单位～25个单位的HCG（根据供试爪蟾的大小）；b)将非洲爪蟾固定在长方形工作台的湿纸巾上，并按下图所示遮住眼睛；c)在背部淋巴囊水平进行背部皮下注射。按照E.关于注射的说明进行相同操作。/index/Details.stGB/TXXXXX—XXXXE.4.1.2用HCG注射雌性非洲爪蟾：a)使用1mL注射器和25号（橙色）针头，吸取500个单位～700个单位的HCG（取决于非洲爪蟾的大小）；b)固定好非洲爪蟾，遮住它的眼睛；c)在背部淋巴囊水平进行背部皮下注射。按照E.关于注射的说明进行相同操作。E.4.2星期二（分选和孵育）E.4.2.1收获卵并使其脱胶。a)收集卵，放在250mL烧杯中，除去过量水分。b)加入足量的2%半胱氨酸溶液覆盖卵，通过旋转烧杯2min或3min将卵与半胱氨酸混合，直至卵解离。重要的是注意不要离开半胱氨酸太久，否则会影响生存。注：这一步很关键，应小心操作。半胱氨酸溶液应升温到21℃左右。温度影响半胱氨酸处理的有效性，如c)向烧杯中加入0.1倍的MMR溶液（几乎至顶部），停止半胱氨酸的作用。d)将液体缓慢倒入漂白溶液烧杯中，取出液体，并用0.1倍MMR再次冲洗3次。e)从烧杯中轻轻倒入，将胚胎放入带注释的100mL大培养皿中。E.4.2.2对胚胎进行分选（死亡与存活），大多数胚胎应处于囊胚期。a)将培养皿置于双目显微镜下，用移液管将每个受精卵分离到一个新的100mL培养皿中，培养皿中含有0.1倍MMR溶液与浓度为50µg/L的庆大霉素溶液。b)标记培养皿：行号、交配日期、每个培养皿的卵子数。在21℃±1℃下避光孵育培养皿。E.4.3星期三（分选和更换培养液）a)从培养箱中取出培养皿。b)按照前一天的做法，使用切断尖端的移液管对胚胎进行分选，取出死亡的胚胎。c)更新一半培养液，并补充0.1倍MMR溶液与浓度为50µg/L的庆大霉素溶液。d)将培养皿置于21℃条件下，在21℃±1℃下避光孵育。E.4.4星期四：（准备实验或运送至另一个实验室）E.4.4.1选项1：继续培养直至实验开始。a)向1个水族箱加入0.1倍MMR溶液到四分之一。b)用行号、繁殖日期标记该水族箱。c)在不混合卵的情况下将胚胎轻轻倒入水族箱，每升最多放置200个胚胎。d)将该水族箱置于21℃培养箱中，在黑暗中度过周末。E.4.4.2选项2：将胚胎运输至另一个实验室。a)运输所需材料：——无菌100mL容器（例如，带螺旋盖的组织培养瓶）；——切断尖端的移液管；——移液管(50mL)；——移液管辅助工具。b)在100mL容器（包括瓶盖和瓶身）上添加标记：GB/TXXXXX—XXXX——行的名称；——繁殖日期；——每个容器的胚胎数量。c)向容器中加入50mL试验培养液。d)将100个活胚胎放入容器中。e)仅在准备发送时封闭容器。f)将容器置于可密封的冷冻袋中。g)封闭袋子。h)将容器放入聚苯乙烯盒中，并牢固固定在盒内，使其不会移动。i)小心地盖好盒子，并用胶带固定。j)连夜送往接收方实验室。GB/TXXXXX—XXXX（资料性）可接受稀释水的部分化学特性碱度（以CaCO3计）：10mg/LCaCO3～250mg/L硬度：75mg/L～150mg/LpH值：6.5～8.5盐度：0.4mg/L非离子氨(NH3)<0.02mg/L亚硝酸盐(NO2-)<1mg/L硝酸盐(NO3-)<50mg/L溶解氧>80%饱和度二氧化碳<5mg/L总有机磷农药<50ng/L总有机氯农药+多氯联苯<50ng/L总有机氯<25ng/L铝、砷、铬、钴、铜、铁、铅、镍、锌分别<1μg/L镉，汞，银，分