不同温度对大鼠下丘脑视上核和室旁核的影响

不同温度对大鼠下丘脑视上核和室旁核的影响

热反应是指人们和动物暴露在热环境中，特别是在身体活动引起的非特异性全身反应，如身体疲劳和其他非正式全身反应的总结。它通过影响脑细胞特性,改变认知过程,继而影响人的正常行为和生活质量。下丘脑是一个非常重要的皮质下中枢,在维持机体内环境的平衡中起着非常重要的作用。下丘脑的视前区、下丘脑前区是体温调节中枢,热应激可激活此区的神经元。视上核(supraopticnucleus,SON)和室旁核(paraventricularncleus,PVN)是下丘脑内的重要核团,不仅参与水盐平衡、血压稳定、生殖机能等的整合,而且也参与各种应激反应的调节。虽然关于热刺激引起下丘脑内Fos表达已有不少报道,但结论不一致。而且这些研究多使用单一温度,对不同温度之间Fos表达的比较注意不够。有报道指出在高热刺激下(40～43℃,60min左右),脑内结构(大脑皮质、小脑等)发生损伤性改变,甚至引起凋亡。Fos蛋白是细胞活性的标记物。我们已往的研究表明,Fos蛋白也可作为细胞损伤的标志,在γ射线照射前脑后90d,在脑内发现3种Fos阳性细胞,即Fos阳性胞核、Fos阳性胞浆以及Fos阳性胞核和胞浆。不同程度的高温刺激后动物会发生怎样的变化,SON和PVN细胞的Fos表达如何?本实验模拟24℃,34℃,38.5℃和42℃的热环境,观察了动物的行为学反应和下丘脑SON和PVN内Fos蛋白的表达情况。材料和方法1.饲养环境的分组健康成年雄性SD大鼠40只,购于第四军医大学实验动物中心,体重240～300g,安静温暖、避强光的环境中饲养48h。利用随机数字表将其均分为4组,即24℃(对照组)、34℃、38.5℃、42℃4种不同环境温度组,每组10只。饲养条件为:22±1℃,相对湿度40%～50%,自然昼夜比12∶12h,非直接光照,自由饮食。2.建立热应激动物模型将动物暴露于恒温恒湿动物箱(第四军医大学航空航天医学系自制)中,温度分别为34℃、38.5℃、42℃,相对湿度均为60%,各60min,建立热应激动物模型。同时设24℃组为正常对照组。3.行为观察实验过程中注意观察大鼠在高温环境中的行为表现,如姿势、活动情况及有无出汗等。4.前脑冠状切片动物暴露于恒温恒湿动物箱1h后,用1%戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉,经左心室至升主动脉插管,100ml生理盐水冲洗血液,4℃含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)灌注固定。脑组织置于含20%蔗糖的0.1mol/LPB内(4℃)至沉底。恒冷箱切片机切制含SON和PVN的前脑冠状切片,片厚30μm。切片收集于0.01mol/LPBS中,4℃冰箱保存备用。切片行抗Fos免疫组织化学(ABC法)染色。5.fos-多克隆抗体稀释液切片入0.3%H2O2甲醇溶液20min,PBS液充分漂洗,入0.3%TritonX-100处理后,按ABC法切片依次孵育于:(1)兔抗Fos多克隆抗体稀释液(1∶3000,SantaCruz),24h,4℃;(2)生物素标记的羊抗兔IgG稀释液(1∶500,Sigma),2h,室温;(3)生物素-卵白素-HRP复合物(ABC,1∶500,Sigma),2h,室温。以上每一步骤后均用PBS充分漂洗3次,每次10min,最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法显色(室温),阳性产物呈蓝色,常规裱片、脱水、透明、DPX封固、光镜观察。6.替代实验取实验组切片,用0.01mol/LPBS分别替代抗Fos抗体稀释液,按ABC法进行免疫组化染色,结果为阴性。7.大鼠好c组fos阳性神经元的检测光镜下(BX-60,Olympus,Japan)观察并应用Leica公司的Quantimet570c图像分析仪采集图像。对每组10只大鼠,每只大鼠2张下丘脑PVN和SON切片的Fos阳性神经元进行计数。结果以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,行单因素方差分析(one-wayANOVA)结果1.独立中的病理状态大鼠的基础体温一般为36～38℃。在34℃的环境下,大鼠直肠温度变化幅度不大,未超过39℃,活动正常。38.5℃的条件下,直肠温度常升高达39℃以上;可见头颈部及胸部毛发潮湿,表示有脱水象征;最初大鼠精神萎靡,活动减少,但随直肠温度增高,转为兴奋状态,出现惊跳、逃窜行为。处于42℃的环境中,大鼠的体温达42℃以上,无法用普通温度计测量。2.免疫组织化学2.1pvn和son内的fos阳性胞核对照组大鼠PVN,SON内有少量Fos阳性神经元分布,其胞核为蓝黑色,胞质为阴性,染色浅,散在分布(Fig.1A,E)。34℃时,PVN和SON内的Fos阳性神经元增多,与正常组相比有明显差异(P<0.05,Fig.1B,F)。38.5℃时,PVN和SON内的Fos阳性胞核明显增加,达到峰值,与其他各组比较均有显著差异(P<0.05),Fos阳性胞核分布于整个核团(Fig.1C,G)。42℃时,PVN和SON内的Fos阳性胞核明显降低,与38.5℃组相比,有显著差异(P<0.05,Fig.1D,H)。各组PVN和SON内的Fos阳性细胞计数结果详见表1。2.2fos蛋白表达对照组大鼠PVN和SON内Fos蛋白集中表达在胞核,表现为一圆形蓝色的胞核,胞质为阴性(Fig.1A,E)。34℃和38.5℃时,Fos蛋白仅在胞核表达,染色较深,胞质仍为阴性。42℃时,Fos蛋白阳性产物明显减少,可见到三种细胞,第1种是胞核阳性,胞浆阴性的细胞;第2种是胞浆阳性,而胞核为阴性的细胞;第3种是胞浆与胞核双阳性的细胞。值得注意的是脑内所有对热刺激起反应的部位(大脑皮质、海马、杏仁核簇、臂旁核和孤束核等)的神经元也都出现上述3种表型(Fig.2)。热应激对fos蛋白表达的影响热应激是指人或动物暴露在热环境中,尤其是伴有体力活动时,产生可感知的不适感和疲劳等一系列非特异性全身应答反应的总和。长期的热应激,可引发一系列因生理机能紊乱引起的异常反应,如体温的升高、大量出汗引起机体脱水以及水电解质平衡紊乱,中暑,某些器官或组织受损,认知行为改变,甚至休克和死亡。下丘脑神经元参与感受和调控体温,它是人体的体温调节中枢。因此,研究热应激后,下丘脑内神经元的一系列改变,对于了解热应激影响机体功能的途径、从而进一步运用于临床治疗都很有意义。Fos蛋白作为神经元活动状态的标记物,已被广泛采用。本文采用Fos蛋白免疫标记法,研究了下丘脑PVN和SON内神经元对不同热刺激的反应。原癌基因c-fos是一种胞内的第三信使,它对许多刺激很敏感,但缺乏特异性。为了寻找Fos表达与热刺激的特异性关系,我们对动物的实验条件作了严格的限制,尽量减少不必要的非特异刺激。我们观察到:24℃时,Fos阳性细胞较少,散在分布;热应激后,大鼠中枢内多个部位出现Fos表达。34℃组,PVN和SON内有少量的Fos阳性神经元表达。38.5℃时,PVN和SON内的Fos阳性细胞数量明显增加,达到峰值,大鼠出现出汗,脱水症状。表明此时大鼠体内的渗透压已发生改变,机体处于高渗状态。SON和PVN不仅是维持机体水盐平衡的重要中枢,也参与对损伤、应激等反应的调节,此时Fos蛋白集中分布于这两个核团,说明高温激活了此区的神经元,进而影响动物的行为反应。42℃时,SON和PVN的Fos阳性神经元数量下降,我们推测可能是由于高温使机体受到损伤,各项反应反而处于抑制状态的原因。我们的结果与Tsay等和McKitrick的结果一致。本文另一有意义的结果是:对照组、34℃和38.5℃组大鼠脑内Fos阳性神经元,Fos在胞核表达,染色浅,胞质为阴性;而在42℃时,出现了三种形态的Fos阳性细胞:即胞核阳性,胞浆阴性;胞浆阳性,胞核阴性和胞浆与胞核双阳性的细胞。这与Duan等报道的γ刀照射大鼠后大鼠脑内出现了三种Fos阳性细胞一致。众所周知,当细胞受到刺激后,胞核内c-fosmRNA转移到胞浆,由内质网转录翻译为Fos蛋白,Fos蛋白与Jun蛋白合成二聚体,在AP-1的介导下易位到胞核,激动靶基因。当细胞严重受损时,Fos蛋白从胞浆向胞核的转运机制可能存在障碍,无法向胞核内转运,于是出现了胞浆单阳性的细胞。因此,我们推测,Fos蛋白仅表达在胞核、胞浆为阴性的细胞是正常的反应性细胞,Fos蛋白只表达在胞浆、胞核为阴性的细胞是严重受损的细胞,胞浆、胞核同时表达Fos的细胞是介于两者之间的过渡型细胞。值得注意的是我们