谷氨酸摇瓶发酵

谷氨酸摇瓶补料发酵班级：生物工程091班姓名：XXX学号：XXXXXXXXXXXXX指导老师：XX谷氨酸摇瓶补料发酵摘要：本实验以天津短杆菌为菌种，在不同培养基条件下研究摇瓶补料发酵生产谷氨酸。试验中以0D值检测天津短杆菌的生长状况，以残糖量和谷氨酸生成量控制补料情况。实验结果表明：在相同培养条件（培养温度32°C，培养箱转速240rpm）下，蛋白胨培养基最高产酸为19g/L，玉米浆70%梯度培养基的最高产酸量为12g/L,根据以上结果可以看出，蛋白胨培养基的产酸量高于梯度培养基。关键词：谷氨酸补料发酵OD值残糖量生物素前言：1866年德国H.ittthausen用硫酸水解小麦面粉，分离到一种酸性氨基酸，依据原料的取材将它命名为谷氨酸。1872年Hasiwitz和Habermaan用酪蛋白水解也制得谷氨酸。1908年日本池田菊苗在探讨海带汁鲜味时，提取了谷氨酸，开始制造“味之素”1901年日本味之素公司用水解面筋法生产谷氨酸。1936年美国从甜菜废液（斯蒂芬废液）中提取谷氨酸。1954年多田、中山两人报告了采用微生物直接发酵谷氨酸的研究。直到1956年日本协和发酵公司的木下祝郎分离选育出一种新的细菌——谷氨酸棒状杆菌，能同化利用100g葡萄糖，可直接发酵并积累40g以上的谷氨酸。随后进行了工业化研究，自1957年起发酵法制取味精，正式商业化生产。20世纪60年代后，世界各国也兴起发酵法生产味精，以甘蔗或甜菜、糖蜜、淀粉、醋酸、乙醇为原料，由于石油价格上涨和石油制品的安全性，相继改用糖蜜、淀粉原料为

主的发酵法生产味精。谷氨酸发酵机制：谷氨酸的生物合成途径主要包括：EMP途径、HMP途径、TCA循环、乙醛酸循环、C02固定反应。总反应途径为：糖经过EMP途径和HMP生成丙酮酸。一方面丙酮酸氧化脱羧生成乙酰-CoA；另一方面，经CO2固定作用生成草酰乙酸；两者合成柠檬酸进入TCA循环，由三羧酸循环的中间产物a-酮戊二酸，在谷氨酸脱氢酶的催化下，还原氨基化合成谷氨酸。船萄幣f-磷酸 —磷酸酸*■乙朋匚航戊C£巨亠)丙阳酸臣酰乙酸李果酸(VUH)船萄幣f-磷酸 —磷酸酸*■乙朋匚航戊C£巨亠)丙阳酸臣酰乙酸李果酸(VUH)延胡索酸乙醜G.A柠掾酸（乙能酸循坏）\乙醯酸顺乌尹酸谷氨酸发酵注意事项：在发酵过程中，氧、温度、pH和磷酸盐等的+ 透过细胞膜（ 调节和控制如下：①氧，谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。其中谷氨酸棒状杆菌在溶氧不足时产生的是乳酸或琥珀酸。②温度。菌种生长的最适温度为30~32°C。当菌体生长到稳定期，适当提高温度有利于产酸，因此，在发酵后期，可将温度提高到34〜37C。③pH。谷氨酸产生菌发酵的最适pH在7.0〜8.0。但在发酵过程中，随着营养物质的利用，代谢产物的积累，培养液的pH会不断变化。如随着氮源的利用，放出氨，pH会上升；当糖被利用生成有机酸时，pH会下降。其中谷氨酸棒状杆菌在pH呈酸性时生成乙酰谷胺酰胺。④磷酸盐。它是谷氨酸发酵过程中必需的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。材料和方法1.1材料和仪器菌种谷氨酸短杆菌TG866,广西工学院生物与化学工程学院微生物实验室提供1.1.2材料葡萄糖、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、琼脂、尿素、aCl、KHPO、2 4MgSO、KHPO、HCl、NaOH4 2 41.1.3培养基活化斜面培养基(5支)葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，NaCl2.5g/L，琼脂15~20g/L，PH7.0~7.2，共配50mL，分装10mL/支；灭菌：115C，25min。摆斜面。（2）种子培养基兼发酵培养基（2瓶）葡萄糖100g/L，蛋白胨3g/L,MgSO0.8g/L,KHP03.5g/L,4 2 4KHPOlg/L,20%尿素1.2mL/瓶（接种前在无菌室加入），共配60mL,2 4分装30mL/500mL三角瓶，灭菌：115°C,25min。在无菌室加入1.2mL尿素后，调节7.2~7.5。（3）发酵培养基（2瓶）葡萄糖70g/L，玉米浆3g/L,MgSO0.8g/L,KHPO3.5g/L,4 2 4KHPOlg/L,20%尿素1.2mL/瓶（接种前在无菌室加入），共配60mL,2 4分装30mL/500mL三角瓶，灭菌：115C,25min。在无菌室加入1.2mL尿素后，调节7.2~7.5。所有培养基均调PH7.0~7.2,在115C高温下灭菌15分钟1.1.4相关试剂0.9%生理盐水：称取0.9gNaCl溶解于蒸馏水并定容至100ml。50%葡萄糖：称取40葡萄糖溶解于蒸馏水并定容至80ml，用于补料。20%尿素：称取22g尿素溶于蒸馏水并定溶至100ml,过滤除菌。3mol/LHCL:取12mol/L浓HCL令HCL：H2O为1:3（体积比）配制100ml。加ol/LNaOH:称取8gNaOH固体溶解于蒸馏水并定容至100ml。1.1.5实验仪器与设备超净台，生物传感分析仪，摇床，722光栅分光光度计，移液枪，灭菌锅，光波炉3.2 试验方法1.2.1活化菌种转接活化斜面，将天津短杆菌转接到活化斜面培养基，30°C培养20h.1.2.2种子培养（1） 向已经灭菌的种子培养基（蛋白胨3g/L）加入1.2mL尿素，用加ol/L的NaOH或加ol/L的HCL调至PH7.2，按1mL生理盐水/I支大斜面的用量，将活化斜面的菌种洗下，混匀。按3%的接种量（ImL）接入种子培养基，9层纱布封口，240rpm,32C摇瓶培养7~8h使菌种长至对数生长中后期。这两瓶种子培养基扩陪7~8h后直接用于摇瓶补料发酵30h。（2） 测定OD值：0h测定一次，7h测定一次，若OD值净增0.5以上,即可用于接种发酵培养基。1.2.3摇瓶补料发酵（1） 向已经灭菌的发酵培养基（葡萄糖70g/L）加入1.2mL尿素，用加ol/L的NaOH或加ol/L的HCL调至PH7.2,将种子培养基按10%的接种量（3mL）将种子培养液接入发酵培养基中，混匀。9层纱布封口，240rpm,32C摇瓶培养约30h。（2） 测定OD值、OH、残糖量及谷氨酸量：在无菌台取样0.5mL至离心管中，残夜测定PH,酌情加入尿素0.2~0.6mL补料，使PH维持在7.2~7.5，酌情加入50%葡萄糖补料，使残糖维持在20~30g/L，测定OD值、OH、残糖量及谷氨酸量，0h测定一次，大约每3h测定一次。1.2.4测定方法（1） 菌种生长情况吸取0.5mL发酵液于1.5mL离心管中，8000r/min离心3min。上清液用于测量残糖好人谷氨酸产量，沉淀稀释100倍，用紫外可见分光光度计在620nm波长下测其OD值，菌种的OD值可以反应菌体的浓度，通过菌体浓度可知菌体生长情况。（2） 残糖量和谷氨酸量的测定上1中的上清液稀释100倍，即用0.1mL稀释到10mL比色管中定溶，摇匀，用生物传感分析仪测定残糖和谷氨酸量。（3） PH的测定用PH6.4~8.0的pH精密试纸测定pH值。实验结果和分析2.1实验结果根据发酵培养基的配方不同，含有蛋白胨的培养基简称为蛋白胨1和蛋白胨2；不含蛋白胨，但含有玉米浆的培养基简称为梯度1和梯度2。实验数据如下表:时间PH值残糖/(g/L)谷氨酸/(g/L)OD值补加尿素/mL补加葡萄糖/mL07.25110.610.204.575410.6810.4087.74750.77900117.7406.50.74700137.2377.50.8520.24245.477100.89800275.488100.89800表1蛋白胨1的发酵记录时间PH值残糖/(g/L)谷氨酸/(g/L)OD值补加尿素/mL补加葡萄糖/mL07.2———004.5>85110368001184520.50000137.54230.55800245.43460.7760027<5.43670.82800表2梯度1的发酵记录时间PH值残糖/(g/L)谷氨酸/(g/L)OD值补加尿素/mL补加葡萄糖/mL07.24830.5870.204.57.75060.6980085.44390.7111.5011834110.6980013831140.72705246.483180.79300275.894190.84400表3蛋白胨2的发酵记录2724ooi―L005o54on4y20000V00严2pH363004i―L400544311残糖/(g/L)i―L2oo753i―L11谷氨酸/(g/L)O0063o0032O6O2O444O4500O22611oOOO2OoOOL兄OOOOoOo>4S5W2s^wiru^m“>->———函“苕残糖或谷氨酸含量/(g/L)残糖或谷氨酸含量/(g/u[■<i 4 6 Cd -O-oc- o c- o c-[-J 4 0COOOOOOOOo严500000™iissTLIH6oJTOSiris10009co『值ct1od*od*tlsriim11lMrjpMT即画存梯度1的发酵曲线图10.8°'6營0.4°0.梯度1的发酵曲线图10.8°'6營0.4°0.28 11 13 24 27时间/h060梯度2的发酵曲线8 11 13 24 27时间/h10.80-&埋0.480.20+残糖含量-■-谷氨酸含量值亠残糖含量亠谷氨酸含量*0D值2.2讨论与分析谷氨酸发酵中，糖代谢除受到生物素控制外，也受到NH4+的影响。使用生物素缺乏菌，在NH4+存在时，葡萄糖以很快的消耗速度和高的收率生成谷氨酸。当NH4+不存在时，糖的消耗速度很慢，生成物是a-酮戊二酸、丙酮酸、醋酸和琥珀酸。同时也受到氧、发酵温度等因素的影响。对于生物素的要求：1）菌体生长阶段保证生物素充足，使菌体快速生长；产酸阶段控制生物素亚适量(5-10“g/L)，使谷氨酸大量积累。本实验中，在相同的培养条件下，蛋白胨培养基的产酸量明显高于玉米浆梯度培养基，分析原因有以下几点：生物素的影响在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸能不断地排到细胞外面，就能大量积累谷氨酸。研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。而本实验中所用的玉米浆梯度培养基的产酸量较低，可能原因就是因为其生物素含量对菌体的影响不利于菌体产酸，而蛋白胨培养基中生物素含量较低，但并不影响菌体的前期的生长，所以产算量较高；NH4+的影响NH4+的浓度会直接影响到发酵液的pH，pH值过高或过低都会抑制菌体的生长，从而降低菌体产酸。根据表2、3、4显示，玉米浆梯度培养基在发酵时间为8h和11h时pH至明显偏高，此时菌体可能被抑制生长，导致最后产酸能力降低。3）由于谷氨酸产生菌是好氧菌，通风和搅拌不仅会影响菌种对氮源和碳源的利用率，而且会影响发酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在发酵后期，加大通气量有利于谷氨酸的合成。而在发酵过程中，要定时测定发酵液的OD值、残糖量和产酸量，而且实验分组较多（10）,且很多组不在同一时间测定，所以在操作过程中可能导致发酵液溶氧量不足和温度不稳定，从而导致菌体生长不充分，抑制菌体产酸。结果与小结总的来说，本次实验基本成功