第八章 核酸化学与代谢1课件

111111微生物生理生化胡小兵市政工程专业建筑工程学院二0一五年七月111111微生物生理生化2第八章、核酸化学二、核酸的组成成分三、DNA的结构四、DNA和基因组五、RNA的结构六、核酸生物合成一、核酸的生物学功能七、核酸的分子生物学2第八章、核酸化学二、核酸的组成成分三、DNA的结构四、DN问题DNA分子有几级结构，细菌的DNA的结构如何？基因与基因组有和区别？遗传中发生点突变的依据是什么？生物遗传中发生了“差错”，这是好事还是坏事？细菌的DNA重组主要的方式有哪些？对于难降解的有机物如何筛选与培养特效菌种？分子生物学技术在水处理中有何作用？3问题DNA分子有几级结构，细菌的DNA的结构如何？34一、核酸的生物学功能（一）核酸与遗传信息的传递DNA是基本遗传物质RNA在传递遗传信息上的作用

1)mRNA是蛋白质合成的模板；2)tRNA识别mRNA上的遗传密码，转运特定氨基酸到核糖体上合成肽链；3)rRNA是核糖体的主要成分，是翻译工作的场所。（二）核酸与蛋白质的生物合成DNA有选择地转录为mRNA，tRNA、rRNA也是DNA转录产物。4一、核酸的生物学功能（一）核酸与遗传信息的传递DNA是基本5生物遗传的变异起源于DNA碱基配对的改变。１）由于DNA碱基的颠倒（如TA被颠倒为AT）或被调换（如GC被换为TA）；２）由于在DNA复制过程中被遗漏了一对或多了一对核苷酸；３）或者在转译时发生了差误，如氨酰tRNA合成酶错将一个结构与正常氨基酸十分相似的物质交给tRNA。４）还有一些生物的遗传性状发生了突变。（三）核酸结构改变与生物变异变异和进化都是DNA结构改变而引起蛋白质改变结果。5生物遗传的变异起源于DNA碱基配对的改变。（三）核酸结6（四）遗传工程遗传工程是用人工方法改组DNA，从而培育新型生物品种的技术。实验室中将细菌作材料研究遗传工程过程可分为：（1）重组DNA分子（基因重组）；（2）将重组DNA引入受体细胞（转化或转导）。（五）克隆与克隆化由单一亲代细胞用无性繁殖产生的子代细胞称克隆，形成克隆的过程称克隆化。6（四）遗传工程遗传工程是用人工方法改组DNA，从而培育二、核酸的组成成分核酸nucleicacid核苷酸nucleotide核苷nucleoside磷酸phosphate嘌呤碱purinebase

或嘧啶碱pyrimidinebase（碱基base）核糖ribose

或脱氧核糖deoxyribose

（戊糖amylsugar）二、核酸的组成成分核酸nucleicacid核苷酸nu（一）核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12β-D-2-核糖β-D-2-脱氧核糖O核糖+H+糠醛甲基间苯二酚FeCl3绿色产物Δ脱氧核糖+H+

Δω-羟基-γ-酮戊醛二苯胺蓝色产物RNA和DNA定性、定量测定（一）核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2C（二）嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNNNNHHHH123456789嘌呤NH2腺嘌呤adenine（A）NNNNHHHHOH2N鸟嘌呤guanine（G）（二）嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNNNNHHHH1234NNHHHH123645嘧啶NNHHHHNH2OH胞嘧啶Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶thymine（T）NNHHHH123645嘧啶NNHHHHNH2OH胞嘧啶C（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHH9腺嘌呤腺苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖OHOH2COHOH1′2′3′4′5′核糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（ψ）NH2（三）核苷OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸苷PO--O—O‖胸苷-5′-磷酸AMPP

O--O—O‖~ADPATPP

O--O—O‖~（四）核苷酸OHOH2COHOHOH1′2′3′4′5′核OHO-O

O—CH2

TO=P—O-3′5′OHOHO-O

O—CH2

GO=P—O-3′5′OHO

O—CH2OHOH

AO=P—OO-3′5′3′5′1′PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTAOHO-OO—CH2TO=P—O-3′5′OHOHO-141、各种核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA

和DNA合成的直接原料。2、能量代谢中的能量直接载体。ATP——能量“货币”UTP——参加糖的互相转化与合成CTP——参加磷脂的合成GTP——参加蛋白质和嘌呤的合成核苷酸作用141、各种核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA2三、DNA的结构（一）DNA的一级结构

1)DNA序列常被认为是碱基序列（basesequence)。2)通常碱基序列由DNA链的5′→3′方向写。3)DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4n。三、DNA的结构（一）DNA的一级结构1)DNA序列常16（二）DNA的双螺旋结构16（二）DNA的双螺旋结构17鸟嘌呤－胞嘧啶碱基对腺嘌呤－胸腺嘧啶碱基对17鸟嘌呤－胞嘧啶碱基对腺嘌呤－胸腺嘧啶碱基对18磷酸二酯键18磷酸二酯键192.双螺旋结构模型要点（1）两条多核苷酸链反向平行。（2）碱基内侧，A与T、G与C配对，分别形成3和2个氢键。（3）双螺旋每转一周有10个bp，螺距3.4nm，直径2nm。3.双螺旋结构的稳定因素（1）氢键（太弱）；（2）碱基堆积力（basestackingforce，由芳香族碱基π电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心，是稳定DNA最重要的因素；（3）离子键（减少双链间的静电斥力）。192.双螺旋结构模型要点（1）两条多核苷酸链反向平行。202021212222染色体包装的结构模型多级螺旋模型压缩倍数76405

DNA→核小体→螺线管→超螺线管→染色单体2nm10nm30(10)nm400nm2~10μm

一级包装二级包装三级包装四级包装（三）DNA的三级结构线形分子、双链环状(dcDNA)→超螺旋染色体包装的结构模型多级螺旋模型（三）DNA的三级结构线形分四、DNA与基因组织DNATranscription

RNA（mRNA、tRNA、rRNA）TranslationProtein基因基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。结构基因调节基因基因组四、DNA与基因组织DNATranscription25五、RNA结构25五、262627主要特征：1.四臂四环；2.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有结构；3.D环上有二氢尿嘧啶(D)；4.反密码环上的反密码子与mRNA相互作用；5.可变环上的核苷酸数目可以变动；6.TψC环含有T和ψ；7.含有修饰碱基和不变核苷酸。27主要特征：2828291、原核微生物的单链环状DNA主要采用滚环式复制一）DNA的生物合成-半保留DNA复制的起点和方向5′3′5′3′5′六核酸的生物合成291、原核微生物的单链环状DNA主要采用滚环式复制一）DN302、真核生物DNA的多起点复制Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓn302、真核生物DNA的多起点复制Ｓ１Ｓ２Ｓ３Ｓn31二）原核细胞的DNA复制1.DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ）（dNMP）n+dNTPMg2+（dNMP）n+1+PPi特点（1）不能催化从无到有的聚合反应。（2）催化的反应只能在引物的3′延伸。（3）3′接上的核苷酸决定于模板链。（4）具有5′→3′和3′→5′外切酶活性。31二）原核细胞的DNA复制1.DNA聚合酶Ⅰ（PolⅠ322.PolⅡ和PolⅢPCR（多聚酶链式反应）5′5′1热变性2退火5′5′5′5′3DNA聚合酶5′5′5′5′重复1，2，3PCR反应全过程322.PolⅡ和PolⅢ333.双链DNA复制的分子机制（1）冈崎片段和半不连续复制5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′复制叉上DNA合成的三种可行性333.双链DNA复制的分子机制（1）冈崎片段和半不连续34（2）冈崎片段的RNA引物利福酶素对RNA聚合酶有抑制作用。氯霉素对蛋白质合成有抑制作用。引物RNA在复制过程中暂时存在，最后通过PolⅠ的5′→3′外切酶活力水解。（3）DNA连接酶催化一条DNA链的3′末端与相邻的另一条DNA链的5′末端之间的磷酸二酯键的合成。34（2）冈崎片段的RNA引物利福酶素对RNA聚合酶有抑制作35

其它功能：（1）修补双螺旋DNA中单股的缺口；（2）连接线状双螺旋DNA以产生环状DNA；（3）重组过程中将几段DNA链连接起来。（4）母本DNA双链的分离DNA解螺旋酶（DNAhelicase）拓扑异构酶Ⅱ（typeⅡtopoisomerase）35其它功能：（4）母本DNA双链的分离DNA36（5）DNA聚合酶的“校对”作用DNA聚合酶的3′→5′外切酶活力是校对新生DNA链和改正聚合酶活性所造成“错配”的一种手段。4.真核细胞DNA的复制（1）真核细胞DNA复制有多个起始点。（2）至少有5种DNA聚合酶，即α、β、γ、δ、ε。（3）端粒由端粒酶催化复制。生物细胞DNA复制分子机制的基本特点。36（5）DNA聚合酶的“校对”作用DNA聚375.反转录作用利用反转录酶可制造与任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的互补DNA（cDNA）。6.DNA的损伤与修复（1）DNA损伤的各种结构变化①碱基缺失或插入②碱基改变③形成TT二聚体（2）修复机制①光复活；②切除修复；③重组修复；④SOS修复375.反转录作用利用反转录酶可制造与任何R387.重组修复5′5′重组修复5′三位科学家TomasLindahl、PaulModrich和AzizSancar因“DNA修复的机制研究”获2015年诺贝尔化学奖。387.重组修复5′5′重组修复5′三位科学家To39391）细菌的转化39391）细菌的转化404041412）细菌的转导41412）细菌的转导423）

细菌的结合423）438.细菌的限制—修饰系统限制性核酸内切酶5′—G—T—T—A—A—C—3′3′—C—A—A—T—T—G—5′5′—G—T—TA—A—C—3′3′—C—A—AT—T—G—5′平头末端HpaⅠ5′—G—A—A—T—T—C—3′3′—C—T—T—A—A—G—5′5′—G—T—TA—A—C—5′3′—GA—A—T—T—C—3′粘性末端EcoRⅠ438.细菌的限制—修饰系统限制性核酸内切酶5′—G—T44二RNA的生物合成（一）转录转录产物有mRNA、tRNA、rRNA。1.原核细胞的转录E.coli的RNA聚合酶中，α2ββ′称为核心酶。σ因子辨认模板DNA的起始位点。44二RNA的生物合成（一）转录转录产物有mRNA、t452.真核细胞的转录真核细胞RNA聚合酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类。3.转录产物的加工（1）rRNA前体的转录后加工原核细胞30S前体17S25S16S23S5S真核细胞45S前体18S28S5.8S（2）tRNA前体的加工（3）真核细胞mRNA的加工452.真核细胞的转录真核细胞RNA聚合酶有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三468、DNA的分子生物学技术(后面我来讲）方法应用局限性变形梯度凝胶电泳(DGGE)利用基因序列和长度差异分析群落多样性，适于分析较多种微生物条带序列较短，灵敏度有限，不能定量末端限制性片段长度多态性分析(T–RFLP)利用限制性位点差异分析群落多样性，快速，半定量分析限制性酶切不完全；高效高通量需要多次反复酶切克隆文库(Cloninglibrary)利用序列差异和测序可知群落中各种群系统分类；为新引物和探针设计提供信息克隆步骤耗时较长,

不适合大量分析,不适合反应器监测荧光原位杂交(FISH)原位定量和识别特定菌群背景荧光会干扰检测，探针的穿透性差会造成假阴性实时荧光定量PCR(QRT-PCR)目标基因的扩增和定量分析不适合各种基因的快速同时分析；PCR高灵敏度易造成污染基因芯片(Microarray)高通量快速检测群落多样性，鉴定微生物并明确其生态作用环境样品特异性和灵敏度低，不能定量，样品处理复杂，仪器贵重468、DNA的分子生物学技术(后面我来讲）方法应用局限性变47变形梯度凝胶电泳微生物群落遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的多态性。变性剂梯度

低

高PCR等长DNA产物1234567聚丙烯酰胺凝胶到达变性梯度时DAN解链，速度下降ABCDEFG47变形梯度凝胶电泳微生物群落遗传多样性以及PCR48DGGE技术主要操作过程如下:样品预处理;

样品DNA(或RNA)提取及纯化;16SrDNA或基因片段的PCR扩增;预实验(DGGE条件优化);

制胶;样品的DGGE分析;图谱分析;条带序列分析。48DGGE技术主要操作过程如下:样品预处理;49DGGE过程示意图49DGGE过程示意图50DGGE特点：DGGE技术快速简便、分离效果好。从理论上讲，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，DGGE技术对于DNA片段的分辨率可以达到一个碱基差异水平，DGGE法只能对微生物群落中数量上大于1%的优势种群进行分析。DGGE技术无法提供代谢活性、细菌数量和基因表达水平方面的信息。50DGGE特点：DGGE技术快速简便、分离效果好。从理论51应用举例：----变形梯度凝胶电泳（DGGE）分析生化反应器微生物51应用举例：一、取样与预处理1、微生物取样

稳定运行条件下，不同温度条件(1)生物强化一体化反应器的填料上生物膜(2)生物滤塔填料上生物膜。52一、取样与预处理1、微生物取样52532、样品预处理----土壤基因组提取试剂盒快速提取生物膜中的总DNA具体操作如下：1）取0.1-0.3g污泥（生物膜）样本，加入1mlBufferSW，涡旋振荡1-3min（让管底的污泥土壤振动起来），12000rpm离心1min，倒去上清液；2）加入750μl70%乙醇，涡旋振荡1min，12000rpm离心1min，倒去上清液；并用移液枪吸尽余液；3）在污泥中加入500μlBufferSL，涡旋振荡1-3min，65℃水浴20min，每隔5min涡旋振荡5秒；4）12000rpm离心3min，上清液移至1.5ml离心管中；上清液中加等体积BufferSGL，颠倒混匀15-20次，冰上放置5min，室温12000rpm离心5min；5)上清液转入SpincolumnDM微试管中（管内先放1个2mlcollectiontube），12000rpm离心1min，弃废液，将2mlcollectiontube重新放入SpincolumnDM微试管；532、样品预处理----土壤基因组提取试剂5454556)向SpincolumnDM加入500μlBufferGWS，12000rpm离心1min，弃

废液，将2mlcollectiontube重新放入SpincolumnDM微试管；7)向SpincolumnDM中加入700μlBufferGW1，12000rpm离心1min弃废液，2mlcollectiontube重新放入SpincolumnDM微试管；8)向SpincolumnDM中加入500μlBufferGW2，12000rpm离心1min弃废液，2mlcollectiontube重新放入SpincolumnDM微试管；9)将2mlcollectiontube重新放入SpincolumnDM微试管中，最大转速离心2min，将SpincolumnDM管中上清液转到1.5ml离心管中，打开盖子，室温放置数分数以充分晾干；10)再加入5-100μlBufferGE，12000rpm离心1min，把离心管中的液体重新加到原来的SpincolumnDM管中。室温放置1min，12000rpm离心1min，液体离心管中溶液（DAN样品）放置冰箱-20℃保存。556)向SpincolumnDM加入500μlB563、DNA提出物分离与鉴别

1)称琼脂糖210ml，加入TBE缓冲液30ml，80℃微波溶化，加入2.0μlgoldview新型核酸染料上胶到电泳槽上。2)把分离的总DNA样品加入到琼脂糖电泳凝胶上，同时点入markerλDNA/HindⅢ。3)电流条件：U=97V，I=61-63mA，电泳时间为1h30min到1h50min。4)然后把DNA分离后的凝胶放到凝胶成像系统中观察DAN分离效果，并拍摄图像。563、DNA提出物分离与鉴别5757二、总DNA提取58Marker58Marker23130bp9416bp6559bp2322bp2927bp二、总DNA提取58Marker58Marker591、反应体系：试剂50ul体系终浓度Fowardprimer（F468）2ul0.4uMReverseprimer（R468）2ul0.4uM2×2TaqMasterMix25ul1×TemplateDNA﹤1ug﹤1ug/reactionRNase-freeWaterUpto50ul三、PCR扩增591、反应体系：试剂50ul体系终浓度Fowardpri6060引物序列Primer名称序列(5'to3')碱基数细菌通用引物F468CGC

CCG

GGG

CGC

GCC

CCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGACTCCTACGGGAGGCAG56细菌通用引物R468GACTACCAGGGTATCTAATCC216060引物序列Primer名称序列(5'to3')碱基数细61步骤温度时间预变性94℃2min变性94℃30s退火55-65℃30s延伸72℃30s终延伸72℃2min变性—延伸，25-35个循环；2、PCR反应条件：61步骤温度时间预变性94℃2min变性94℃30s退火55623、琼脂糖电泳后紫外成像。Marker623、琼脂糖电泳后紫外成像。Marker63四、DGGE分离63四、DGGE分离64DGGE分离具体过程：1）配制高（70%）、低（30%）浓度的变性琼脂糖胶，加入聚合剂TEMED和DGGE染料。

2）用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.5-1.0mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶放架子上打入胶模中，排气，凝胶厚度为3-5mm。3）在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1×TAE缓冲液的电泳槽中，轻轻拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约1mm。64DGGE分离具体过程：654）DNA样品与10×Loading-buffer（含有溴酚蓝和甘油等物质）混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。5）电泳条件：60°C、电泳电压60V，电泳12h后，打开夹板，加入10%EB染料缓冲液中20min，取出夹板，清水冲洗2遍后，擦干放在凝胶放到凝胶成像系统中观察，并拍摄图像。6）用洁净刀片将条带切下，放入1.5mlEP管，送测序公司纯化测序。654）DNA样品与10×Loading-buffer（含有66DGGE产物紫外呈像DGGE条带切割后呈像66DGGE产物DGGE条带切割后呈像五）测序过程（一）测序过程1、对回收的DGGE条带进行二次PCR扩增及产物回收；

2、目的片断TA克隆；3、蓝白斑筛选；4、质粒提取；5、M13+/-测序。