发酵工程制药-酶类药物的发酵制药

生物制药工艺课程蛋白酶的发酵制药

蛋白酶蛋白酶是指催化蛋白质肽键断裂的一类酶，将蛋白质降解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸，广泛存在于动植物以及微生物细胞内，按其作用形式可分为肽链内切酶、肽链外切酶。在蛋白酶的生产应用中按其作用条件分为酸性蛋白酶(如凝乳酶)和中性蛋白酶。工业最大用途洗涤剂，为碱性蛋白酶。蛋白酶的生产工艺流程1.生产菌

2.发酵工艺

3.提取工艺

4.酶的质量测定1.生产菌

蛋白酶分布广，但由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用细菌和霉。酸性蛋白酶(最适pH2-5)产生菌主要是黑曲霉、米曲霉、根霉等;中性蛋白酶(最适pH7-8)产生菌主要是枯草芽孢杆菌、米曲霉、栖土曲霉、灰色链霉菌等;碱性蛋白酶(最适pH9-11)主要产生菌为枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等。2.发酵工艺（1）培养基米曲霉的培养基:豆饼粉7.5%，(NH4)2S040.8%，水40%，KH2P040.25%，麸皮51.45%。黑曲霉的培养基(g/L):新鲜麸皮8.25，米糠4.5，豆饼粉1.5，(NH4)2S04O.3，K2HP04O.06，CaCl20.075，水8.6mL，pH5.5。（2）工艺流程（3）发酵条件装料量30g/250mL三角瓶，采用变温培养，32℃堆积培养48h，进行翻料，将温度调至28℃继续培养至120h。3.提取工艺

取发酵原料，以缓冲溶液浸提后，离心获得粗酶粉。浓缩酶制备工艺流程为:发酵液→絮凝→离心→活性炭脱色→纸板过滤→超滤浓缩。1)絮凝取刚下罐的发酵液100mL，加人质量分数为0.1%的絮凝剂NaAl02，室温搅拌10min，然后倒人100mL量筒中观察沉降情况，并记录清液出现时间为分层时间，每隔5min测定清液高度，至120min为止。2)离心将发酵液装人离心管中，在4℃条件下8000r/min离心。3)脱色选择中颗粒活性炭进行发酵液脱色，用量为1%。4)纸板过滤过滤纸板由孔径30-50µm的棉花纤维、石棉和硅藻土组成，纸板过撞机的压力为0.3MPa。5)膜浓缩由于蛋白酶的分子质量为28kDa，因此选用聚丙烯膜的MMCO(截留分子质量)为20kPa，操作压力为0.05MPa，温度控制在lO℃左右。4.酶的质量测定酶性质的测定:将一定量冷冻干燥后的酶粉溶于pH3.0乳酸缓冲溶液中，制成酶溶液，测定酶的最适温度和pH，通过Sephadex-G75凝胶过滤层析及SDS蛋白质电泳分析，此蛋白酶的分子质量范围为55-60kDa。生物制药工艺课程淀粉酶的发酵制药11

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，是最早实现了工业生产并且是迄今为止用途最广、产量最大的一个酶制剂品种。主要的淀粉酶可分为四大类：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶（糖化酶）和异淀粉酶。这些淀粉酶中比较重要的是α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。枯草菌BF7658，α-淀粉酶是我国产量最大、用途最广的一种液化型α-淀粉酶，广泛应用于食品制制药、纺织等许多方面。α－淀粉酶生产工艺12菌种微生物培养法微生物培养条件细菌液体深层发酵中性至微碱性霉菌固体曲法微酸性一般在酶活达到最高峰时结束发酵，离心以硅藻土作为助滤剂去除菌体及不溶物。在钙离子存在下低温真空浓缩后，加入防腐剂、稳定剂以及缓冲剂后就成为成品。13

为制造高活性的淀粉酶并便于贮运，可把发酵液用硫酸铵或有机沉淀剂沉淀制成粉状酶制剂，最好贮藏在25℃以下、较干燥避光的地方。利用蛋白酶比淀粉酶的耐热性差的特点，将α－淀粉酶的发酵液加热处理可以使淀粉酶的储藏稳定性大为提高。在培养基中添加柠檬酸盐可抑制某些菌株产生的蛋白酶，用底物淀粉进行吸附也可将淀粉酶和蛋白酶进行分离。141.生产工艺流程试管斜面培养基↓三角瓶种子↓种曲培养↓厚层通风培养↓烘干↓粗酶制剂↓酿造等用粉碎↓抽提↓过滤↓沉淀↓压滤↓烘干↓成品↓供助消化药、酿造等用←调配（一）米曲霉固态法α-淀粉酶生产工艺151.原料将试管斜面（于32-34℃培养70-72h），接种到500mL三角瓶（每瓶一菌耳种菌），摇匀于32-34℃下培养3d，每24h扣瓶一次以防结块，待菌体大量生长孢子转出黄绿色时，即可作为种子用于制备种曲。2.发酵麸皮、米糠、稻壳、木薯粉、豆饼浸出液16种曲房要保持清洁，并定期用硫磺和甲醛熏蒸灭菌。种曲培养一般采用木制或铝制曲盒，培养基经高温灭菌后放入种曲箱房，打碎团块冷却到30℃左右接入0.5～1％的三角瓶种子，拌匀后放入曲盒，料层厚度1cm左右为宜。盒上盖一层布后放入专用的木架上，曲房内保持30℃左右进行培养。盖布应每隔8～12h用水浸湿，以保持一定湿度，每24h扣盘一次，经3d后，种曲成熟，麦麸上布满黄绿色孢子。厚层通风固体发酵，蒸煮1h后培养基冷却到30℃接入0.5％的种曲，拌匀后入池发酵。前期品温控制在30℃左右，每隔2h通风20min，当池内品温上升至36℃以上时则需要连续通风，使温度控制在34～36℃。当池内温度开始下降后2～3h则通冷风使品温下降到20℃左右出池，整个发酵过程约需要28h。2.提取直接把麸曲在低温下烘干，作为酿造工业上使用的粗酶制剂，特点是得率高、制造工艺简单，但酶活性单位低，含杂质较多。把麸曲用水或稀释盐水浸出酶后，经过滤和离心除去不溶物后用酒精沉淀或硫酸铵盐析，酶泥滤出烘干，粉碎后加乳糖作为填充剂最后制成供作助消化药、酿造等用的酶制剂。特点是酶活性单位高，含杂质较少，但得率低、成本高。18

α-淀粉酶生产工艺

枯草杆菌BF-7658淀粉酶是我国产量最大、用途最广的一种液化型α-淀粉酶，其最适温度65℃左右，最适pH6.5左右，pH低于6或高于10时，酶活显著下降。其在淀粉浆中的最适温度为80～85℃，90℃保温10min，酶活保留87％。（二）枯草杆菌BF-7658深层液体发酵1.生产工艺流程无菌空气BF-7658菌种↓孢子斜面↓种子罐↓发酵罐↑热处理↓盐析↓压滤↓干燥↓粉碎↓混粉↓成品←硫酸铵补料罐→硫酸铵废液←填充料202.生产工艺操作(1).斜面孢子培养一般采用马铃薯培养基，于37℃下培养72h，使菌体全部形成孢子即为成熟。茄子瓶(2).孢子悬浮液用50ml无菌生理盐水洗下(3).种子及发酵培养工艺配方

种子培养基的组成为豆饼粉、玉米粉、NaHPO4、(NH4)2SO4、CaCl2、NH4Cl等。在37℃、搅拌转速300r/min、通气量1：（1.3-1.4）体积比的条件下培养12-24小时（对数生长期）

碳源：淀粉、玉米粉、木薯粉、浓度为2-8％。氮源：工业上常用玉米浆、豆饼粉、硫酸氨和硝酸钠等。无机盐：钙离子对酶的稳定有利，适当的磷盐有利于酶的产生，锰锌铁对微生物产酶有刺激作用发酵温度37℃、搅拌转速200r/min，通气量0-12小时1：0.67-0.74，12小时发酵结束1：（1.0-1.33），周期为40-48小时。补料从12小时开始，每小时一次，分30余次补完，补料体积相当于基础料的1/3，停止补料后6-8小时，温度不再上升，菌体衰老，酶活不再升高，发酵即可结束，发酵完毕，发酵液中加入2％CaCl2和0.8％Na2HPO4，并加热至50-55℃维持30分钟，（破坏蛋白酶，促使胶体凝聚），然后冷却到40℃进行提炼。种子罐3M3发酵罐30M3总配比基料补料豆饼粉45.65.35.5玉米粉3117.222.3Na2HPO4

0.80.80.80.8(NH4)2SO4

0.40.40.40.4NH4Cl0.150.150.130.2淀粉酶10-15万单位100万单位30万单位CaCl2

-0.20.130.4体积12m3

4m3

种子及发酵培养工艺配方（4）.发酵管理发酵控制温度37℃，罐压0.5atm，通气量：0-12小时，1:0.74；12小时以后1:（1.0-1.33），。发酵后期控制在0.9VVM。中间补料：12小时后，每隔1小时补料一次直至多40小时左右。补料结束后6-8小时，升至7.5，营养细胞80%不空泡，酶活不增加，放罐。种子培养维持罐温37℃，罐压0.5-0.8atm，10h后加大通风，当菌体处于对数生长期后期，立刻接种至大罐，种子培养一般14h左右。通风比：种子罐0-10小时，1:1.3；10-14小时1:1.45A.种子发酵管理B.发酵灌管理补料优点：（低浓度发酵和高浓度补料）有利于菌体生长产酶发酵后残糖、残氮低，便于提取高浓度补料可以保持环境稳定，延长产酶期，增强菌体产酶的诱导作用，增加产酶量

发酵培养一般采用补料工艺，一方面可解除分解代谢阻遏效应，另一方面也有利于pH的调节，最终达到提高产量的作用。补料体积和基础培养基体积一般为1:3左右。从10h左右开始补加，一般前期、后期少，中期大，根据菌体的生长情况来调整。a当pH低于6.5，细胞生长粗壮时可酌减；当pH高于6.5，细胞出现衰老并有空胞时可酌增，发酵周期一般为40h。3.提取预处理：发酵完毕，向发酵液中加入2％CaCl2与0.8%Na2HPO4,并加热至50－55℃维持30min（破坏蛋白酶，促使胶体凝聚）然后冷却到35-40℃进行提炼。（1）.盐析法发酵液（35-40℃）加硅藻土助滤过滤洗涤滤饼（2.5倍水）合并滤液浓缩盐析、过滤滤饼烘干粗酶制品45℃真空40%(NH4)2SO4沉淀物加硅藻土压滤发酵液加1%Na2HPO4、1％CaCl2、0.5%NaCl，pH6.3－6.5,65℃15min凝聚处理冷却到30℃压滤除渣酶液浓缩至含固形物35％－40％乙醇提取离心分离沉淀物50℃热风干燥薄膜蒸发器加与其干物等量淀粉，搅拌缓加2倍量10－15℃乙醇，终浓度60％，搅拌、静止沉淀粗酶制品（2）.乙醇淀粉吸附法chemicalengineeringdepartment25℃调整硫酸铵溶液饱和度计算表工业上回收α-淀粉酶一般采用硫酸铵盐析法。硫酸铵浓度、酶液的浓度和pH对盐析效果都有影响，甚至α-淀粉酶来源或菌种不同对硫酸铵浓度的要求也不同，如枯草杆菌α-淀粉酶的硫酸铵浓度一般为37～50％不等。

（2）提取一般采用盐析法提取，在热处理后冷却到35-40℃的发酵液中加入硅藻土（助滤剂）过滤，滤饼加2.5倍水洗涤，将洗涤水和滤液合并，于45℃真空浓缩数倍，加硫酸铵40％盐析，盐析物加入硅藻土进行压滤，滤饼于40℃烘干磨成粉即为成品。本工艺的总收率为70％。也可以将滤液直接进行喷雾干燥制成酶粉，但这样成品含杂质多且有臭味，蒸汽耗量大，且容易吸湿。生物制药工艺课程纳豆激酶的发酵制药

人体内的血栓常引发脉管栓塞、脑血栓中风、急性心肌梗塞等严重的心脑血管疾病，对中老年人的身体健康造成了很大的危害，目前全世界有血栓患者约1500万人，潜在的溶栓剂市场有20亿美元。但当前的溶栓剂，如尿激酶(SK)和链激酶(UK)，它们作为第一代溶栓剂，缺乏纤维蛋白选择性，副作用大；第二代溶栓剂如重组组织型纤溶酶原激活剂，存在着价格高的缺点等，难以成为适用于大众的药品。而纳豆激酶具有溶栓能力强、无任何毒副

作用、成本低、可由细菌发酵生产等优点，市场前景极为诱人。须见洋行博士简介“天然物/生理机能素材研究委员会”会长

日本仓敷艺术科学大学产业科学技术学部学部长

著名生命科学家“纳豆激酶”的发现者震惊—世界下午两点半实验1987年，平时非常喜欢日本传统饮食的须见洋行博士，有一天早晨看见饭桌上的纳豆后，突然想起血栓的主要成分不就是纤维蛋白吗？那么同样是蛋白发酵而生成的纳豆对溶栓会不会有一些作用呢？下午两点半的时候，须见洋行博士把提取的纳豆加入到人工血栓中，原本准备第二天来看实验结果，五点的时候，他看了一眼，奇迹发生了……纳豆激酶的性质纳豆激酶(Nattokinase,NK;也称SubtilisinNAT,SubtilisinBSP)是由纳豆菌(Bacillussubtilisvar.natto)产生的一种具有强烈溶栓功能的蛋白酶，是一种枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)，属于水解酶类，催化蛋白质的水解。酶的分子量为27728，远小于尿激酶的分子量54000。其pI值为8.6。活性效果用固有单位FU表示。纳豆激酶的生产工艺

可以从纳豆菌的发酵液中提取得到纳豆激酶。由于纳豆激酶是胞外酶，故可省去了细胞破碎和缓冲液抽提的步骤。具体方法如下：

（1）将购买或从纳豆中分离筛选得到的菌株接种到液体培养基中，37℃恒温培养，4000rpm离心30min，取上清液，即为粗酶液。

（2）用硫酸铵分级沉淀的方法除去杂蛋白、多糖等。取上清液缓慢加入硫酸铵至25％饱和度，低温过夜，4000rpm离心30min去除杂蛋白，再取上清液，在上清液中再加入硫酸铵至终饱和度为60％，低温过夜，4000rpm离心30min除去多糖类物质，收集沉淀，溶于缓冲液中，得到的为粗酶液。（3）粗酶液经透析脱盐，除去硫酸铵。（4）为了最终获得符合要求的产物，将样品进行多级层析，目的是先层析浓缩样品和去除杂质，再层析去除残存杂质、目的蛋白的多聚物或降解片段。凝胶