动物dna提取方法的研究进展

动物dna提取方法的研究进展

随着酶原的发展，对动物进行了物种识别、物种起源、多样性、亲水性和系统进化的研究是目前动物分子学研究的最有效手段。然而,由于野外取材的局限性,很多材料都必须经过处理后,带回实验室进行DNA提取,加大了提取DNA的难度,从而导致进一步实验的不稳定性,造成资源和时间的浪费。因此,总结不同保存条件下提取结构完整DNA方法是很有必要的,本文将近年来诸多动物DNA提取方法进行了比较综述。1从损伤中提取的材料dna1.1个二价阳离子辅助用乙醇保存动物标本是最常用且最有效的一种方法,王义权等和蔡振媛等曾比较过用含50mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的70%乙醇、70%乙醇保存动物材料的DNA提取,发现含50mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)的70%乙醇材料DNA降解较少。由于大多数DNA酶需要一个二价阳离子作为辅助因子(如Ca2+、Mg2+等),在70%的乙醇中加入适量EDTA,EDTA可以迅速抑制DNA酶的活性,进一步减少DNA的降解。莫邦辉等在酒精标本DNA模板快速提取中没有用蛋白酶K,仅在缓冲液(0.5%SDS,10mmol/LTris-HCl,100mmol/LEDTA,pH8.0),37℃温浴1h作用下消化材料,也获得了较好的扩增结果,但本方法仅适用于短片段的PCR扩增。一般经典酒精标本DNA提取方法都会加入蛋白酶K,且在56℃条件下消化8~14h,以达到组织中蛋白质的完全消化。田宗城等认为在提取乙醇保存的组织标本之前,先将标本在蒸馏水中清洗过夜,除去标本中的酒精,减少对蛋白酶K活性的影响,同时在提取过程中将稍微剪碎的尾鳍组织小块直接放入DNA提取液中,37℃水浴过夜,这样得到的DNA机械断裂的机会少,提取液经RNA酶处理,酚、氯仿和异戊醇反复抽提,即可得较纯的DNA产物。1.2样品处理和dna提取在以往的研究中对于福尔马林标本的DNA提取方法已经有了较大的改进,首先,在预处理标本上,有梯度酒精浸泡和临界点干燥法。而用梯度酒精预处理标本的方法,使乙醇与标本中的甲醛反应生成半缩醛和缩醛,再通过酒精更换被清除出标本。许黎美等认为将两种预处理方法结合起来使用,效果更佳。徐来祥等为了防止标本大量吸水造成细胞严重破坏,采用PBS溶液(磷酸缓冲液PhosphateBufferSolution)结合乙醇溶液浸泡洗脱样品,也取得了较好的实验结果。在DNA提取过程中,周美玉等和杜世章等都用了一种抗氧化剂二硫苏糖醇(DTT),DTT能有效地抑制甲醛进一步氧化为甲酸,而甲酸会造成DNA的降解,因此抗氧化剂的加入对基因组DNA的提取起着关键性作用。Paabo和Su也曾提出在提取过程中要加入DTT,以提高DNA的产率。同时,Baneljee等提出福尔马林保存标本在空气中暴露时间越长,福尔马林发生氧化程度就越大,其提取的DNA完整性就越低。徐来祥等的实验也证明了这种观点,保存时间较长的鳗鲡标本由于密封较好,氧化程度低,反而比保存时间短但密封性不好的仓鼠肝脏中提取的DNA更完整。1.3酚-氯反复抽提法DNA提取中回顾性的研究大多都是从石蜡包埋组织中提取的。经典的石蜡包埋组织DNA提取是用二甲苯脱蜡,蛋白酶K消化,酚-氯仿反复多次抽提,这种方法不仅操作复杂,污染大,而且提取的DNA部分断裂,丢失,严重影响实验结果,为此,很多学者做了进一步的改进。如:经典的快速提取DNA方法是没有经过酚-氯仿反复抽提,直接将含有蛋白酶K的裂解液置于37℃恒温水浴3h后,95℃加热10min,1400r/min离心5min即可,这种方法既避免了酚-氯仿反复抽提对人体的伤害,同时也简化了步骤,提高效率。丛娟等在此基础上进行了部分改进:将含有蛋白酶K裂解液的标本,置于70℃恒温水浴,再将消化过程中的标本置于55℃恒温水浴过夜,后再经酚-氯仿反复抽提,也得到了较纯的DNA产物,但操作还是相当复杂,易污染。高凌云等又提出了一种简易的提取方案,此方法不用二甲苯脱蜡,而加入了非离子去污剂Tween20,通过改变细胞膜表面的张力,来加强蛋白酶K对蛋白质的降解作用。避免了传统二甲苯脱蜡造成DNA破坏,引起PCR产物阳性率降低,减少了二甲苯对人体的危害,同时,提取的整个过程在一个EP管中完成,避免了繁琐而费力的酚-氯仿反复抽提造成的DNA丢失和污染,保证PCR反应的质量,还可以处理大量标本,达到快速、经济目的。2非损伤性取样:量遗传物质检测新方法80年代中期以来,由于PCR技术的广泛应用,已经能对极少量遗传物质进行检测,由此产生了一类新的取样方法——非损伤性取样(noninvasivesampling)。这种方法的样品来源可以是动物的皮张标本、脱落的毛发、粪便、尿液等。2.1价金属离子络合利的作用从陈旧皮张中提取DNA,目前,已有不少学者在某些实验对象上取得了成功,但往往都过于烦琐、实验周期长,因此,很多学者希望能找到更好的提取方案。饶刚等认为在提取过程中加入Chelex(螯合树脂)能提高DNA的产率,在高温条件下一些金属离子可以作为DNA降解的催化剂作用,而Chelex是一种对多价金属离子具高亲合力的一种螯合树脂,能通过螯合这些金属离子来阻止DNA的降解,这样可从微量样品中得到较高分子量的DNA。同时,由于陈旧皮张中含有大量的角蛋白、胶原蛋白等对蛋白酶K有着较强耐受性的蛋白,为了能很好地消化材料,绕刚等又提出了在对标本前处理时,消化液组分中以钙盐代替钠盐,这是由于蛋白酶K有两个Ca2+结合位点,它们与催化机理虽无直接关系,但如果从该酶中除去Ca2+,由于出现远程的结构变化,催化活性将丧失80%左右。所以,加入含Ca2+的消化液,增强消化液的消化效果,可以使实验周期成倍缩短,也简化了操作步骤。同样,为了更好地消化材料,兰宏等采用了含有胶原蛋白和胰蛋白酶的PBS消化液,这是由于胶原蛋白能在适当的条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构;而胰蛋白酶能选择地水解蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链,能消化溶解变性蛋白质。同时,Paabo认为从动物死亡到标本完全干燥的时间越长,标本保留的DNA分子就越大,这点对于DNA提取成败也起着关键性作用。2.2不同提取方法所获得dna的量和时间及对pcr过程的影响从毛发中提取DNA,相关报道已有很多。余舰等在蛋白酶K(56℃)作用下,采用酚-氯仿反复抽提法就已经从毛发中提取了微量的DNA。徐艳春等和伍新尧等用Chelex-100处理毛发制备DNA,达到1根毛发提取得到的DNA即可得到较好的实验结果,但用此方法对毛囊细胞裂解不够彻底,残留的消化液对后继的PCR过程有一定的影响。而后,李军林等在常规的酚-氯仿提取法的基础上加以优化,以pH8.8Tris-HCl、MgCl2溶液和蛋白酶K为裂解液消化,使其获得了较高质量的DNA。赵春江等在此基础上加以改进,以常用的PCR缓冲液、MgCl2溶液和蛋白酶K为裂解液,在PCR上设置一个单循环程序:65℃30min,95℃15min,4℃10min,而后瞬时离心PCR管,上清液即可做PCR模板。此法采用的较高消化温度(65℃),可使蛋白酶K在较短时间内高效地消化毛囊中的蛋白质,使细胞释出DNA;PCR的缓冲液中含有的Tris碱和PCR缓冲液的pH值,可在DNA提取过程中起到保护DNA、防止降解的作用;在PCR仪上,95℃15min过程可使蛋白酶K灭活,防止过剩的蛋白酶K在PCR过程中消化Taq酶而使PCR扩增无法进行。该方法可以用于大量标本的处理,且效果较好。2.3血液dna的提取从血液样本中提取DNA关键是去除红细胞及蛋白质。常规的方法是:先得到淋巴细胞,再用蛋白酶K、SDS消化,然后用酚氯仿抽提、乙醇沉淀。但此方法操作复杂,且试剂对身体有害,不少学者做了进一步的改进。赵权等采用TritonX-100破碎红细胞和白细胞,直接得到白细胞核,然后用NaClO4,SDS解聚核蛋白,而不用蛋白酶K,最后用PCl(酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1)抽提,乙醇沉淀。此方法在去除红细胞方面有了较大提高。霍金龙等在常规方法的基础上又提出了用含有NH4Cl的等渗溶液破碎去除红细胞。这种方法虽然也很好地去除了红细胞,但操作等方面还是很复杂。吴清敏等结合他们方法稍做改进,用含有NH4Cl裂解液和含Tris-Cl的核裂解液逐步对样本做处理,同时用蛋白酶K消化,并在54℃水浴2h,加入6mol/LNaCl,而后离心的上清液经沉淀洗涤,就获得了较纯的DNA产物。此后,赵嘉惠等又提出了TKM血液DNA提取法,此法利用红细胞对低渗环境较为敏感,在去污剂NP-40存在下极易被破坏的原理,在溶液中加入NP-40;在高渗状态下,强阴离子去污剂SDS可将其他血细胞及其细胞器破坏殆尽,经离心将细胞碎片及其他杂质除去,从而达到纯化DNA的目的。而后,戴文申等提出了用Chelex-100