放射毛霉胞外蛋白酶特性研究

放射毛霉胞外蛋白酶特性研究

腐腐乳，又称乳腐、乳豆腐、霉菌豆腐、鲜豆腐、豆腐或长毛豆腐，在中国烹饪。它是在豆腐生产的基础上发展起来的。它的生产起源于魏晋，在明清时期占主导地位。这是中国人民在豆腐生产方面的又一发明。腐乳的营养价值很高，除了含有大量的水解蛋白质、丰富的游离氨基酸和游离脂肪酸以外，还含有相当多的维生素B12，核黄素的含量比豆腐高6～7倍，还含有丰富的钙、磷、铁、锌等矿物质，且不含有胆固醇，具有质构细腻柔滑、滋味鲜美、诱人食欲的特点，是人们喜爱的开胃佐餐食品和调味品，在众多的豆制品中占有十分重要的位置，在欧美，因其质构类似软干酪而被称为中国干酪（Chinese-cheese）。雅致放射毛霉（Actinomucorelegans3.27），异名匍匐放射毛霉，是我国传统腐乳酿造中常用的菌种之一。腐乳生产中，前期培菌时毛霉分泌出以蛋白酶为主的酶系，后期发酵时该酶系连同辅料中的化学物质和酶协同作用，使腐乳成熟，其实质为生化酶学过程。多年来，人们在菌种选育、多菌种混合发酵上做了大量的研究，试图改进腐乳的生产工艺、缩短生产周期。然而，由于缺乏对腐乳酿造中参与酶系特性的研究，尤其是蛋白酶特性的研究，人们无法明了腐乳后酵的生化过程，使得腐乳的生产工艺和品质难以有较大的改进，生产周期长一直是无法克服的弊病。在此背景下，本文结合生产实际，对雅致放射毛霉胞外蛋白酶的酶学特性进行了研究，旨在为简化生产工序、缩短生产周期，为腐乳生产工艺的实质性改进提供理论依据。1材料和方法1.1病毒雅致放射毛霉：北京王致和腐乳厂提供。1.2方法1.2.1粗酶液的提取腐乳毛坯的制作：酶液的提取：取毛坯，从坯体上剥离出菌丝，加入10倍于菌丝重的0.15mol/L的NaCl溶液，于4℃冰箱中过夜提取，6000r/min下冷冻离心10min，得粗酶液，稀释成适当浓度的待测酶液。1.2.2g酪氨酸水解采用QB-1893紫外分光光度法。蛋白酶活力定义：1mL酶液在37℃、1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以U/mL表示。反应混合液由2.00mL酶液和2.00mL酪素组成，在37℃水浴中水解一定时间后用4.00mL三氯乙酸终止反应，在275nm处测定吸光度。空白中先加入4.00mL三氯乙酸终止反应。2结果与分析2.1复合酶系统分析保持一定的酶液浓度，用0.5mol/L的HCl和NaOH调节至不同的pH，测定酶活，结果如图1所示。酶分子上有许多酸性、碱性氨基酸的侧链基团，随pH的变化处于不同的解离状态，从而直接影响酶与底物的结合，或影响酶空间结构以影响酶的活性。根据作用的最适pH，蛋白酶可以分为酸性、中性和碱性蛋白酶。图1显示，雅致放射毛霉胞外蛋白酶的作用范围较宽，在酸性环境中表现出较高活力，在中性和碱性环境中酶活力表现稳定。因此，该胞外蛋白酶应是以酸性蛋白酶为主、兼含中性和碱性蛋白酶组成的复合酶系。由于腐乳后酵过程中的酸度近于中性，所以起主要作用的蛋白酶是活力表现不高的中性蛋白酶。红方腐乳生产中，辅料中添加了红曲和面黄，其中含有丰富的蛋白酶，它们的加入对丰富酶体系、增加总体酶活力，从而促进蛋白质的水解和缩短生产周期起着重要的作用；青方腐乳的汤料中没有外来酶系的引入，因此后酵时间一般长于红方腐乳。2.2观点1.3检测中性处置前后织物上的残留酶活力保持一定的酶液浓度，用0.5mol/L的HCl和NaOH调节至不同的pH，置于25℃水浴中保温1h，再调节至原始的pH，测定剩余的酶活，结果如图2所示。图2显示，雅致放射毛霉胞外蛋白酶保温1h后的残存酶活在中性的环境中表现最高，随着酸度的增加或降低，残存酶活均迅速减少，说明该胞外蛋白酶系中，虽然酸性蛋白酶的活力较高，却很不稳定，保温后的酶活力远远低于中性蛋白酶活力。现行腐乳生产中，保温后酵（25℃）是加速腐乳熟化、缩短生产周期常采用的方法，中性蛋白酶活力在整个后酵过程中的变化是较平稳的，因此，中性蛋白酶在腐乳的后酵中发挥着重要的作用，下面对蛋白酶特性的研究也就以中性蛋白酶为主。2.3温度对质构的影响将一定浓度的酶液分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃的水浴中保温1h，冷却至室温后，测定残存的酶活，结果如图3所示。图3显示，雅致放射毛霉胞外蛋白酶在25℃～40℃之间的热稳定性良好；40℃以后，随着保温温度的增加，酶活力迅速降低；当保温温度达到60℃以上时，蛋白酶几乎全部失活。2.4温度对立地条件下2种外消化酶的影响取一定浓度的酶液，分别测定其在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃时的酶活力，结果如图4所示。温度对酶促反应速度的影响有2方面：温度上升使底物能量增加，分子碰撞概率增加，从而使反应速度加快；但是，当温度上升超过某一界限时，酶蛋白逐步变性，有活性的酶减少，酶反应速度反而降低。图4说明：雅致放射毛霉胞外蛋白酶在较宽的温度范围内（45℃～55℃）具有较高的酶活力，在55℃时酶活力表现最高，随着温度的降低和升高，酶活力均迅速减弱。从蛋白酶对温度的稳定性（图3）和最佳作用温度（图4）来看，生产中还可以采用更高的温度以加速大豆蛋白质的水解，缩短后酵时间，但需要综合考虑提高温度对腐乳其它质量指标和风味可能产生的不利影响。2.5nacl对其蛋白质活力的影响保持底物浓度一定，用20%的NaCl溶液调节底物的盐度，使NaCl含量分别为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，测定等浓度酶液的酶活，结果如图5所示。图5说明，低浓度（<2%）的NaCl溶液对雅致放射毛霉胞外蛋白酶有激活作用，随着NaCl浓度的增高，蛋白酶活力增加；当NaCl浓度大于2%时，NaCl对蛋白酶起着抑制作用，蛋白酶活力随着NaCl浓度的增加缓慢下降；当NaCl浓度高于8%以后，蛋白酶活力随着盐度的增加迅速降低。我国商品腐乳中，NaCl的含量大多在10%左右，含量高的可达到14%以上，高盐度使蛋白酶的活力仅维持在很低的水平，大大的减弱了蛋白酶的作用，不利于腐乳的成熟，这是腐乳后酵时间长的主要原因之一。因此，开发低盐腐乳，不仅可以降低腐乳的含盐量，使腐乳品质更趋于科学化，也是缩短腐乳生产周期的有效途径。2.6黄水的酶活情况保持底物浓度一定，分别用0.1%的CaCl2和MgCl2溶液调节底物盐度，使CaCl2和MgCl2含量分别为0.004%、0.006%、0.008%、0.01%、0.02%、0.03%，测定等浓度酶液的酶活，水解液的OD值如图6所示。黄泔水是腐乳白坯制作时点浆、蹲脑后析出的高浓度有机废水，常用做青方腐乳汤料的配制。由于点浆时所用盐卤（主要成分是CaCl2和MgCl2）的浓度高达20°Bé～24°Bé，在黄泔水中不可避免的残存有CaCl2和MgCl2。图6显示，适量的CaCl2和MgCl2对雅致放射毛霉胞外蛋白酶有激活作用，当含量达到0.08%时，激活效果最好。因此，在青方腐乳汤料的配制时，应酌情考虑黄泔水中CaCl2和MgCl2含量，使其有利于蛋白酶的作用。3成柔糯米功能性产品后酵是腐乳白坯经前期培菌后加入辅料后熟的过程。在此过程中，大豆蛋白质全部得到降解，凝胶结构完全被破坏，最终形成柔糯细腻、