五通桥毛霉产中性蛋白酶发酵培养基优化研究

五通桥毛霉产中性蛋白酶发酵培养基优化研究

腐腐是中国传统的大豆发酵产品，在世界营养林艺术部占有特殊地位。其口味鲜美、风味独特、营养丰富,是深受大众喜爱的佐餐食品,被称为“东方奶酪”。酿造腐乳包括一系列的物理化学和生物化学过程,大豆浸泡、磨浆、点浆、压榨成型制成豆腐的工序属于物理化学过程,豆腐前发酵培菌和加辅料后发酵等主要属于生物化学过程,每一道工序都会影响其品质。在腐乳生产过程中有多种微生物和酶参与,其共同作用造就了腐乳的独特风味、营养和一些特殊的保健功能。腐乳发酵阶段是微生物发挥作用的主要阶段,发酵阶段可分为前期培菌和后期发酵。前期培菌是在半开放条件下培养微生物的酶系;后期发酵主要是酶系与微生物协同参与生化反应的过程。因此,腐乳的生产离不开微生物。常用于生产腐乳的微生物有毛霉、根霉、米曲霉、酵母菌、红曲霉及细菌等,其中,毛霉产蛋白酶种类较多、产酶能力较强。本研究以腐乳生产常用的雅致放射毛霉和五通桥毛霉为实验菌株,通过对发酵培养基进行优化,提高毛霉产中性蛋白酶的酶活力,从而缩短腐乳发酵周期、解决腐乳生产受季节限制的问题,提高腐乳的生产效率、满足市场需求。1材料和方法1.1试剂、仪器和仪器雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)菌种编号3118、五通桥毛酶(WutungkiaoMucor)菌种编号40477购于中国工业微生物菌种保藏管理中心;氯化钙、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、碳酸钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、蔗糖分析纯,西陇化工股份有限公司;三氯乙酸分析纯,天津市巴斯夫化工有限公司;黄豆粉、豆坯哈尔滨珍味粮油冷冻产品商贸集团公司;可溶性淀粉、葡萄糖分析纯,天津科密欧化学试剂有限公司;硫酸镁分析纯,天津博迪化工股份有限公司;乳糖、麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、酪蛋白、福林酚分析纯,北京奥博星生物技术有限公司。80-2B型台式低速离心机湖南星科科学仪器有限公司;722E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司;手提式压力蒸汽灭菌器浙江新丰医疗器械有限公司;无菌操作台北京东联哈尔仪器制造有限公司;SY-2-4型电热式恒温水浴锅天津欧诺仪器仪表有限公司;电子天平北京赛多利斯科学仪器有限公司。1.2最佳碳源及浓度的确定1.2.1酶液制备取出于28℃、pH6.0条件下,发酵60h的毛霉发酵液于80目的网筛过滤去菌丝,之后将滤液在4000r/min下离心20min;取1.0mL滤液于100.0mL容量瓶中,用磷酸缓冲溶液定容至100.0mL,即制得稀释酶液。1.2.2中性蛋白酶酶活测定方法按照国家标准(GB/T23527-2009),采用Folin-酚法测定中性蛋白酶活力。1.2.3毛霉产中性蛋白酶发酵培养基的优化1.2.3.1碳源种类及浓度对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响在发酵培养基中,分别添加10%的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉五种碳源,以10%大米粉作参照,并加入2%的豆坯、0.5%的NaCl配制培养基。每500mL三角瓶装液量150mL,调节pH6.0,0.1MPa、121℃灭菌30min。冷却后接入孢子数为×106、2%的毛霉孢子悬液,于28℃下培养60h,充分发酵后制成粗酶液,测定中性蛋白酶酶活力,确定最佳碳源种类。根据上述实验结果,分别添加8.0%、9.0%、10.0%、11.0%、12.0%的蔗糖作为碳源,在相同条件下,测定毛霉产中性蛋白酶酶活力,确定碳源最适添加比例。1.2.3.2氮源种类及浓度对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响在发酵培养基中,分别添加浓度为2%酵母膏、黄豆粉、豆坯、硫酸铵四种氮源,以2%蛋白胨为参照,并加入10%的蔗糖(五通桥毛霉为8%)、0.5%的NaCl配制培养基,其他条件与1.2.3.1相同,测定毛霉产中性蛋白酶酶活力,确定毛霉产中性蛋白酶最佳氮源种类。根据上述实验结果,分别添加1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%比例的黄豆粉作为氮源,在相同条件下,充分发酵后制成粗酶液,测定毛霉产中性蛋白酶酶活力,确定氮源最适添加比例。1.2.3.3无机盐种类及浓度对毛霉发酵产中性蛋白酶酶活力的影响由于无机盐种类及添加量对毛霉菌发酵产酶影响很大,故本实验以相关的研究资料及参考文献[12-14]为依据,分别在毛霉发酵培养基中添加四种无机盐成分,MgSO40.04%、NaCl0.5%、KH2PO40.4%、CaCl20.1%,以空白作参照,并加入10%的蔗糖(五通桥毛霉为8%)、3%的黄豆粉,其他条件与1.2.3.1相同,充分发酵后制成粗酶液,测定毛霉产中性蛋白酶酶活力,确定最佳无机盐种类及浓度。根据上述实验结果,KH2PO4的添加量分别为0.3%、0.35%、0.4%、0.45%、0.5%;CaCl2的添加量分别为0.06%、0.08%、0.1%、0.12%、0.14%。同时添加其他辅料配制培养基,同样根据蛋白酶活力确定两种无机盐的最适添加浓度。1.2.3.4毛霉产中性蛋白酶发酵培养基的正交优化根据上述单因素实验,以蔗糖添加量、黄豆粉添加量、KH2PO4、CaCl2为四个影响因素,采用正交实验设计L9(34)安排实验,以毛霉产中性蛋白酶酶活为指标,进行正交优化实验,因素水平表见下表1和表2。1.3数据的统计与分析本实验采用单因素及无空列正交实验,每组实验做三次平行实验,研究了几个影响因素对毛霉产中性蛋白酶的影响,并使用SPSS17.0统计软件对实验所得数据进行统计分析,最后通过极差分析得出各个影响因素的显著性。2结果与分析2.1蔗糖对毛霉产蛋白酶酶活的影响由图1可知,本实验所使用的几种碳源,均可被两种毛霉利用产生蛋白酶。蔗糖和葡萄糖对于蛋白酶的合成有较好的促进作用,其中蔗糖对于蛋白酶合成的诱导作用要显著优于其他碳源(p<0.05),两种毛霉菌产蛋白酶酶活分别达1227.68、1196.19U/mL。葡萄糖有利于毛霉菌丝体的生长,但对于蛋白酶合成的诱导作用无蔗糖明显(p<0.05)。故将蔗糖选为毛霉发酵培养基的最佳碳源。由图2可知,随着蔗糖的加入,两种毛霉菌的产蛋白酶酶活均有所升高;在蔗糖浓度在8%~9%之间时,蛋白酶酶活上升较显著(p<0.05);当蔗糖浓度达到10%时,蛋白酶酶活也达到最大值1242.05U/mL和1208.74U/mL;但此后,随着蔗糖浓度继续升高时,蛋白酶酶活开始下降,可能是由于过多的蔗糖利于菌丝体的大量生长繁殖而抑制了蛋白酶的生成。故毛霉发酵培养基的碳源浓度选为10%。2.2最佳氮源的确定由图3可知,本实验所提供的几种氮源,均可被两种毛霉利用产生蛋白酶。其中黄豆粉的促进作用较明显(p<0.05),雅致放射毛霉和五通桥毛霉蛋白酶酶活分别达1245.42、1230.28U/mL,而其他几种氮源虽可被毛霉利用,但对于蛋白酶合成的诱导作用没有有利的影响(除酵母膏外),蛋白酶酶活没有基础培养基的酶活高。故将黄豆粉选为毛霉发酵培养基的最佳氮源。由图4可知,随着黄豆粉的加入,两种毛霉菌的产蛋白酶酶活均有所升高;在黄豆粉添加量在1%~2%之间时,蛋白酶酶活上升较显著(p<0.05);随后,蛋白酶酶活上升较缓慢,但仍呈上升趋势;当黄豆粉添加量在3%时,蛋白酶酶活达到最大值1260.38、1245.37U/mL,故毛霉发酵培养基的氮源添加量选为3%。2.3基于mgso4和cacl2的诱导毛霉产氧化酶由图5可知,MgSO4、KH2PO4和CaCl2相对于NaCl而言,在提高蛋白酶酶活的影响较显著(p<0.05)。添加MgSO4、KH2PO4和CaCl2的培养基中,雅致放射毛霉的蛋白酶酶活力分别达到了1270.46、1287.36、1280.32U/mL;五通桥毛霉蛋白酶酶活力分别达到了1260.16、1270.15、1272.76U/mL;磷酸盐在发酵液中起到了缓冲体系pH的作用,对保持产酶环境的稳定,同时也同MgSO4和CaCl2一起起到了诱导毛霉产蛋白酶的作用。综上所述,在优化毛霉蛋白酶发酵培养基优化方案中的无机盐选择为MgSO4、KH2PO4和CaCl2。因为MgSO4的添加量0.04%很小,故对另两种无机盐设置浓度梯度实验。由图6可知,随着KH2PO4的加入,两种毛霉菌的产蛋白酶酶活均有所升高。雅致放射毛霉在KH2PO4添加量在0.3%~0.35%之间时,蛋白酶酶活上升较显著(p<0.05);当KH2PO4添加量超过0.40%时,蛋白酶酶活出现下降趋势,即当KH2PO4浓度为0.40%时,蛋白酶酶活达到最大值1283.53U/mL;对于五通桥毛霉,当KH2PO4浓度为0.35%时,五通桥蛋白酶酶活达到最大值1282.58U/mL,故KH2PO4的最佳浓度分别选为0.40%和0.35%。由图7可知,随着CaCl2的加入,两种毛霉菌的产蛋白酶酶活均有所升高。对于雅致放射毛霉,CaCl2添加量在0.06%~0.1%之间时,蛋白酶酶活上升;当CaCl2添加量超过0.1%时,蛋白酶酶活下降;当CaCl2浓度为0.1%时,雅致放射毛霉蛋白酶酶活达到最大值1288.05U/mL。而CaCl2浓度为0.08%时,五通桥毛霉蛋白酶酶活达到最大值1286.02U/mL。综上,两种毛霉发酵培养基的最佳CaCl2浓度分别选为0.1%和0.08%。2.4打造不同添加量的小细胞培养基2.4.1雅致放射毛霉发酵培养基正交优化的结果与分析在单因素实验的基础上,以A:蔗糖、B:黄豆粉、C:KH2PO4、D:CaCl2的添加量为四个因素进行正交实验设计,以毛霉产中性蛋白酶酶活力作为评价指标。选用L9(34)正交表对雅致放射毛霉发酵培养基的最佳参数进行优选,采用SPSS17.0进行分析,结果见表3。由表3中实验结果及极差RB>RC>RD>RA可知,四个因素对雅致放射毛霉产中性蛋白酶的影响趋势为B>C>D>A,即黄豆粉添加量对雅致放射毛霉产中性蛋白酶的影响最显著,其次为KH2PO4、CaCl2、蔗糖添加量。最佳参数组合为A2B1C2D3,即当蔗糖添加量为10%,黄豆粉添加量为2.5%,KH2PO4添加量为0.4%,CaCl2添加量为0.11%时,雅致放射毛霉产蛋白酶酶活最高达1310.56U/mL。2.4.2五通桥毛霉发酵培养基正交优化结果在单因素实验的基础上,以A:蔗糖、B:黄豆粉、C:KH2PO4、D:CaCl2的用量为三个因素进行正交实验设计,以蛋白酶酶活作为评价指标。选用L9(34)正交表对五通桥毛霉发酵培养基的最佳参数进行优选,采用SPSS17.0进行分析,结果见表4。由表4中实验结果及极差RB>RD>RC>RA可知,四个因素对五通桥毛霉产中性蛋白酶的影响趋势为B>D>C>A,即黄豆粉添加量对五通桥毛霉产蛋白酶的影响最显著,其次为CaCl2、KH2PO4、蔗糖添加量。最佳参数组合为A2B2C3D1,即当蔗糖添加量为10%,黄豆粉添加量为3.0%,KH2PO4添加量为0.37%,CaCl2添加量为0.07%时,五通桥毛霉产中性蛋白酶酶活力达1306.38U/mL。3中性蛋白酶酶活力本研究以雅致放射毛霉和五通桥毛霉为实验对象,研究了不同发酵培养基成分及添加量对毛霉产中性蛋白酶酶活力的影响,得出雅致放射毛霉产中性蛋白酶的最佳发酵培养基为:蔗糖添加量为10%、黄豆粉添加量为2.5%、KH2PO4添加量为