细胞生物学3.细胞生物学研究方法

TechniquesinCellBiology细胞生物学研究方法光学显微镜技术（lightMicroscopy）电子显微镜技术(Electromicroscopy)扫描探针显微镜（ScanningProbeMicroscope）第一节细胞形态结构的观察方法一光学显微镜技术（lighticroscopy）复合显微镜：现今使用的光学显微镜都是由几个透镜组合而成，所以又称为复合显微镜。构成：（1）光学放大系统:（2）照明系统：（3）机械和支架系统原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。

显微镜适合的放大倍数放大倍数：是眼睛看到像的大小与对应标本长度大小的比值。放大倍数＝目镜的放大倍数X物镜的放大倍数人眼的分辨能力在0.1mm左右

①固定：可使生物大分子交联，蛋白质成分凝固，防止细胞自溶和破坏而产生人工假象。常用固定剂：甲醛、戊二醛、乙醇②包埋：便于切片，防止样品移位,常用包埋剂：石蜡③切片：生物样品太厚，不能直接用光镜观察，需切成1～10μm的薄片

④染色:

苏木精－对负电荷分子有亲和力，可显示细胞内核酸的分布伊红－可使细胞质染色

2、光学显微镜的样品制备与观察苏木精-伊红染色，又称“苏木素-伊红染色”，或“H&E染色”（hematoxylinandeosinstain、HEstain），是组织学最常用的染色方法之一。这种染色方法的基础是组织结构对不同染料的结合程度不同。染料苏木精可以将嗜碱性结构染成蓝紫色，而伊红可以将嗜酸性结构染成粉红色。嗜碱性结构通常包括含有核酸的部分，如核糖体、细胞核及细胞质中富含核糖核酸（RNA）的区域等。嗜酸性结构则通常由细胞内及细胞间的蛋白质，如路易体（Lewybody）、酒精小体（Mallorybody）、细胞质的大部分等。正置显微镜倒置显微镜（二）荧光显微镜FLUORESCENCEMICROSCOPE概念：是以紫外线为光源激发生物样品中的荧光物质，产生能观察到的各种颜色荧光的一种光学显微镜。特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；自发荧光:由细胞本身存在的物质经紫外线照射所发出的荧光。诱发荧光:一些细胞成分本身经紫外线照射后不发荧光，但用荧光染料（酸性品红、甲基绿、吖叮橙等荧光色素）进行活体染色或固定后切片染色，就能在荧光镜下看见荧光，这种荧光叫诱发荧光。什么是荧光？当一个物体吸收了紫外光（短波光）的能量，物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出比原来吸收的波长更长的光为“荧光”。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。染色

不染色

激发光发射光

荧光显微镜的种类

透射式

落射式荧光显微镜的在生命科学中的应用：

荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。荧光显微镜是目前在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具。

蝾螈肺细胞的有丝分裂(240x),荧光。/AlexeyKhodjakov,纽约健康部门Wadsworth中心。（三）激光共聚焦扫描显微镜

是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像的一种光学显微镜。WHATISCONFOCALMICROSCOPY

Theresolutionofimagesobtainedwithconventionalmicroscopyareseriouslydeterioratedbythe"contamination"oftheimageplanewithout-of-focuslightWIDEFIELDCONFOCAL共聚焦扫描显微镜的成像基本原理分辨率可以比普通荧光显微镜的分辨率提高1.4～1.7倍由于点对点扫描去除了杂散光的影响conventionalconfocal可获取连续光学切片优点：多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物LCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)2008年的诺贝尔化学奖授予了从事有关“绿色荧光蛋白质的发现,表达和发展”并取得重要成就的三位科学家:下村修、马丁·查尔菲和钱永健。绿色荧光蛋白改造的蜜蜂（四）相差显微镜

相差显微镜（PHASECONTRASTMICROSCOPE）是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。用途：观察未经染色的玻片标本相差显微镜观察的活细胞（五）微分干涉差显微镜在相差显微镜原理的基础上发明其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。。DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）

微分干涉差显微镜的应用：

(Differential-interferencemicroscope)DIC显微镜使细胞的细微结构立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。微分干涉显微镜还可用于研究活细胞中较大的细胞器。将微分干涉显微镜接上录像机，可以观察活细胞中的颗粒及细胞器的运动。二、电子显微镜

一、分类：透射电子显微电镜（TransmissionelectronMicroscopeTEM）扫描电子显微电镜（ScanningelectronMicroscopeSEM）扫描隧道显微镜各种光及电子束的波长透射电子显微电镜1、电子显微镜与光学显微镜的基本区别

显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理光镜电镜200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束(0.01-0.9)玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差2、电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数

电子显微镜的分辨率可达0.2nm，其放大倍数为100万倍。上述放大倍数称之为有效放大倍数；如继续通过光学手段放大也不会得到任何有意义的信息，因此称之为“空放大”。电镜的分辨本领:

是指电镜处于最佳状态下的分辨率。实际情况下，电镜的实际分辨率常常受到生物制样技术本身的限制，如在超薄切片样品中其分辨率约为超薄切片厚度的1/10，即通常切片厚度若是50nm，其实际分辨率约为5nm，远低于电镜的分辨本领0.2nm。

由于电子束穿透力很弱，因此用于电镜观察的标本须制成厚度仅20－50nm

的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。1.

超薄切片技术二、主要电镜制样技术：超薄切片铜网取材:要快，避免损伤，标本必须薄，小固定:常用戊二醛和四氧化锇固定，四氧化锇除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。脱水:等级梯度脱水，用脱水有利包埋。包埋:为制成超薄切片,并使切片耐受高真空、电子轰击,切片前需包埋,常用环氧树脂。切片:将样品制成50～100nm厚的薄片。染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成,散射电子能力弱,无明暗反差,需进行染色。常用的染色剂：醋酸铀、枸橼酸铅。透射电镜标本制备过程:

观察组织、细胞内部超微结构。分辨率0.2nm。标本在荧光屏上呈黑白反差的结构影像。电子密度高、电子密度低：被重金属浸染呈黑色的结构，称电子密度高；反之，浅染的部分称电子密度用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处和样品周围铺了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5NM左右。示肌动蛋白纤维

二负染色（negativestaining）技术亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。三冰冻蚀刻技术①将标本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低温冰冻。

冰冻蚀刻技术的操作步骤:②然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，细胞内外凡含水多的地方因失水而下陷,暴露出了断裂面的膜和其它一些结构,增强了断面的浮雕效果－蚀刻。③标本蚀刻后，再向断裂上以45°喷金,90°喷碳后将样品浸泡于腐蚀液中将生物组织腐蚀掉，只剩下铂－碳复型膜。④复膜显示出了标本蚀刻面的形态，捞于载网上干燥后可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。复膜

细胞冰冻断裂后的电镜图像（二）扫描电子显微镜20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。分辨力为6~10NM，由于人眼的分辨力（区别荧光屏上距离最近两个光点的能力）为0.2MM，扫描电镜的有效放大倍率为20000X。扫描电子显微镜原理工作原理：

是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。扫描电子显微镜生物样品制备的基本操作程序扫描电镜照片展示不同倍率的果蝇扫描电镜照片扫描电镜照片展示可以用计算机将黑白照片处理成彩色扫描电镜照片展示人类精子（三）扫描隧道显微镜SCANNINGTUNNELINGMICROSCOPE，

分辨率：X-Y向0.1nm（原子级分辨率）扫描隧道显微镜是用来显示物质表面原子排布的一种显微镜，它是根据量子力学中的隧道效应而设计的。

扫描隧道显微镜原理示意图

探针和物体之间加上电压。如果探针距离物体表面很近——大约在纳米级的距离上电子会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离发生变化，这股电流也会相应的改变。这样，通过测量电流我们就能知道物体表面的形状，1、原子级高分辨率。如STM在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达0.1nm和0.01nm，即可以分辨出单个原子，具有原子级的分辨率。

2、可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤。这些特点适用于研究观察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白质等)的原子布阵和一些生物结构(如生物膜、细胞壁等)的原子排列,而不需要特别的制样技术，并且探测过程对样品无损伤——纳米科学水平。扫描隧道显微镜的优越之处：第二节细胞组分的分析方法

一、用超离心技术分离细胞器与生物大分子及其b

复合物二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显b

示方法三、特异蛋白抗原的定位与定性四、细胞内特异核酸的定位与定性一、用超离心技术分离细胞器与生物大分子及其合物各种离心技术——离心是研究亚细胞成分和生物大分子的基本手段。1924年svdberg发明了世界上第一台分析超速离心机。离心机：普通：8000rpm以下；高速：8000~25000rpm；超速：25000rpm以上，达十几万rpm。一般步骤：匀浆化离心处理收集分析（一）差速离心DIFFERENTIALCENTRIFUGATION主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。差速离心

低速离心

中速离心

高速离心

超高速离心

细胞匀浆细胞核仁细胞骨架大细胞器小细胞器核糖体大分子

2、等密度离心法：

按细胞组分的浮力密度不同进行分离的方法。适用于大小、形态相似而密度不同的组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化铯的密度梯度沉降在达到与自身密度相等的位置就停滞不再向下沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。密度梯度离心分离溶酶体、线粒体和微体CsCl密度梯度离心分离DNA密度大于1.3g/cm3

原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。

利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括糖类、脂类、核酸、酶等。二、细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法核酸显示方法－－－－Feulgen反应Feulgen和Rossenbeck(1924)发明，对DNA的反应具有高度专一性。原理:

标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红与醛基反应，形成含有醌基的化合物，醌基为发色团，呈现出紫红色。Feulgen反应糖类显示方法－－－过碘酸雪夫反应（periodicacidSchiffreaction,PAS反应）基本原理：过碘酸的氧化作用先使糖分子的乙二醇基变为乙二醛基，后者继而与Schiff试剂（无色亚硫酸品红复合物）结合，形成紫红色反应产物。酶组织化学染色法基本原理：

是利用酶对其相应底物的水解、氧化等作用，然后再使底物的反应产物与某种试剂发生反应，形成沉淀或有色的最终产物，借此检测该酶在组织切片或细胞内的分布及活性强弱。Electronmicrographofacellshowingthelocationofaparticularenzyme(nucleotidediphosphatase)intheGolgiapparatus.Athinsectionofthecellwasincubatedwithasubstratethatformedanelectron-denseprecipitateuponreactionwiththeenzyme

脂类物质包括脂肪和类脂。标本用甲醛固定，冷冻切片，脂类保存较好。多用苏丹染料、油红O、尼罗蓝等溶于脂类的染料染色，使脂质呈色。也可用四氧化锇（OSO4）染色，脂肪酸或胆碱可使OSO4还原为OSO2而呈黑色。

2．脂类显示方法

二十世纪70年代以来，免疫学的迅速发展为细胞生物学的研究提供了强有力的手段，特别是在细胞内特异蛋白的定位与定性方面，单克隆抗体与其它一些检测手段相结合发挥了重要作用。免疫细胞化学技术与免疫电镜是最常见的研究细胞内蛋白质分子定位的重要技术。三、特异蛋白抗原的定位与定性

免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry）利用抗原和抗体的结合具有高敏感性和特异性的特点，用已知的经过标记的抗体检测组织与细胞中相应抗原的方法。常用的标记方法：1)荧光标记：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明2)酶标记：辣根过氧化物酶（HRP）3)胶体金标记：即金的水溶液，具有一般溶液的特性，用它与抗体标记后，经抗原抗体反应可定位抗原的存在。免疫荧光技术就是将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧光标记技术相结合用来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。常用的萤光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。实质就是用结合有荧光素的抗体与组织内抗原反应，在荧光显微镜下观察抗原的存在部位。也可分为直接法和间接法。

它主要包括荧光抗体的制备，标本的处理，免疫染色和观察记录等过程。标本处理有多种方法，组织切片、冰冻切片都可应用，其宗旨只有一个，即要尽量完好地保持被检测蛋白的抗原性；免疫染色就是抗原抗体反应的过程，这里要注意设立各种实验对照以检验结果的可靠性。主要步骤：炭疽杆菌24h培养物直接荧光抗体检测间接荧光抗体检测细胞培养中的猪瘟病毒核酸杂交原理四、细胞内特异核酸的定位与定性

四、细胞内特异核酸的定位与定性

原位杂交(insituhybridization)：

在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术，称为原位杂交(insituhybridization)。原位杂交技术首先是在光镜水平上发展起来的，放射性同位素标记的探针与样品中的DNA或RNA杂交后，用显微放射自显影的方法显示杂交物的存在部位；或用荧光素标记的探针进行杂交，在荧光显微镜下直接显示与探针杂交的核酸存在部位。原位杂交技术在显微与亚显微水平上研究基因定位、特异mRNA表达等问题的研究中起重要作用。荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH):FISH技术的原理图解放射性同位素发射出的各种射线能使照相乳胶中的卤化银晶体还原(感光)。利用这样的特性，用放射性化合物脉冲标记活细胞,经固定、切片后在暗处把感光乳胶覆盖于切片上,在此期间,由于放射性同位素衰变使乳胶曝光,经显影、定影,根据银粒所在部位,就可知道细胞中放射性物质的分布。这种利用放射性物质使照相乳胶膜产生该物质自身影像的技术，称为放射自显影术。五、放射自显影术

细胞培养

（一）动物细胞培养（二）植物细胞培养第三节细胞培养、细胞工程与显微操作技术

细胞培养

就是将动植物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞或直接以单细胞

生物，给予必要的生长条件，让其在培养瓶中或培养基上继续生长与增殖。

是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养（primaryculture）：

大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织

将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。

适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞

传代培养：

细胞株:通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的细胞称为细胞株。如转基因、基因敲除、被标记等。细胞株(CellStrain)

：

细胞系（CellLine）：原代培养物经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（LineageofCells）所组成。如果传代培养不超过10左右，称为有限细胞系（finitecellline）。如果细胞能连续传代培养的，称为连续细胞系（continuouscellline）。如果细胞能无限传代培养，称为永生化细胞系（immortalcellline）。细胞系（cellline）

:当培养细胞分裂增殖相互间密切接触时，细胞停止活动的现象为接触抑制。（非正常细胞如癌细胞除外）。接触抑制和密度依赖性实验室中常用的几种细胞系细胞系名称细胞类型来源3T3胚胎成纤维细胞小鼠HeLa宫颈癌上皮细胞HenriettaLacksBHK21成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl上皮细胞袋鼠L6成肌细胞大鼠PCI2嗜铬细胞大鼠