第六章 DNA的体外重组与转移

外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第六章DNA的体外重组与转移重组DNA分子的构建需要考虑三个因素（P155）（1）实验步骤要尽可能地简单易行；（2）连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；（3）外源基因必须在表达载体的启动子下，并置于正确的ORF中，以便目的基因的表达。第一节重组DNA分子的构建一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。优点：实验操作简单，易于回收外源DNA片段缺点（P156）（1）不易定向克隆（2）难插入特定的基因（3）大片段DNA的重组率低（4）载体易发生自身串联（5）目的片段自身各拷贝之间可能自连1、一种限制性核酸内切酶酶切的粘性末端间的连接ligasenick碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化用识别序列完全不同的一对限制性酶同时消化一个特定的DNA分子，将会产生具有两个不同粘性末端的DNA片段，并可使该片段按一定方向插入到载体分子上，当然载体分子需用同一对限制性内切酶处理。2、不同限制性核酸内切酶酶切的粘性末端的连接另外，可应用同尾酶（识别序列不同，但末端相同）连接。连接后，形成的重组子不被原来的酶识别切割，但有时可被第三种酶的识别切割。回收同尾酶的连接对于两个不能互补的粘性末端的连接，通常采用平头末端的连接方式，即先将其处理成平头末端，再连接，具有两种情况。（1）5‘突出末端的补平：大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段；（2）3’突出末端的切平：T4噬菌体DNA聚合酶或S1核酸酶。平头末端连接的缺点：连接效率低、破坏原有的识别序列、双向插入及多拷贝插入。二、平头末端的连接1、直接连接T4DNA连接酶虽然能直接连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。同聚加尾法2、人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片段加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补④缺点：③优点：不易自身环化、连接效率高、所有DNA片段均可用此法。非酶切位点操作繁锁、外源片段难以回收、有可能影响外源基因的表达。用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（1）衔接物（linker）连接①linker用化学合成法合成的一段8-12bp的含有特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用3、人工接头法

④缺点：a、可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段，需进行甲基化保护及去保护，该操作较繁琐。b、能给载体连接上Polylinker:③优点：（2）DNA接头(adapter)连接法1978年康奈尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。接头连接在载体上以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。⑤防止自我连接Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’但接头会自我连接接头5‘P-GATCCCGG-OHHO-GGCC-P5’5’P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P-5’CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP处理-OHHO-接头Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’切口切口HO--OHCIP处理T4ligase再用T4多核苷酸激酶处理后连接外源DNA，连接过程中此缺口也被连接三、PCR产物的连接1、在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。避免与所扩增的DNA片段内部酶切位点重复。引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--3’GCAGAATTC互补序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互补序列PCR产物5’--3’3’复性延伸模板模板3’3’CCTAGGCGG互补序列模板BamHI位点-5’3-’5’复性延伸模板模板3’3’CCTAGGCGG互补序列-5’3’-模板5’CCTAGGCGGPCR产物互补序列5’3’引物2带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--3’CCTAGGCGGPCR产物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCCEcoRI位点BamHI位点AATTCPCR产物5’--3’CCTAGPCR产物-5’3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！2、与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用末端脱氧核苷酸转移酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA四、DNA体外连接应注意的事项1、插入片段与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。2、DNA插入的方向正确用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3、插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码子尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGCGAATTC载体GGAGAATTC

ATGCAG…插入片段EcoRIEcoRIATGCGAATT

CATGCAG…重组但移码突变！4、防止载体自身环化连接（1）提高插入片段的用量连接反应体系中，插入片段比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片段以单链连接。5’3’载体插入片段（3）用同聚物加尾法处理载体2.载体自身环化连接（能存活）3.载体之间互相连接（能存活）4.插入片段互相连接（不能存活）5.一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA插入片段的连接结果6.几个载体与一个插入片段重组（能存活）1.一个载体与一个插入片段重组（能存活）受体细胞：能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞。根据细胞的种类可分为三类：*原核生物受体细胞*植物受体细胞*动物受体细胞第二节重组体导入受体细胞1、原核生物受体细胞特点：1）染色体裸露，便于外源DNA重组2）基因组简单，便于进行遗传分析3）单细胞生物，易于获得一致性受体细胞4）培养条件简单，生长快，实验周期短主要的原核受体细胞：

大肠杆菌，枯草杆菌，蓝细菌等应用*构建基因组文库*表达基因产物*保存和扩增目的基因2、植物受体细胞特点：1）具有体细胞全能性，一个分离的活细胞在合适的条件下可分化成植株2）具有坚硬的细胞壁，可以纤维素酶处理获得原生质体.应用：转基因棉花，水稻，玉米，马铃薯，烟草3、动物受体细胞特点1）体细胞一般无全能性，只能分化到细胞株2）生殖细胞、胚胎细胞等具有全能性，可分化、培养成转基因动物应用转基因羊，鼠，兔，猪，牛，检测动物核酸疫苗的表达等。一、重组体导入原核细胞（一）感受态大肠杆菌的制备处于能吸收外源DNA分子的生理状态的细胞。2、目的增加受体菌细胞膜的通透性。1、概念使用丧失了限制体系的大肠杆菌。3、菌种（以E.coli为例）在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，增加细胞膜的通透性。转化时加入DNA后，Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙，即可使外源DNA进入细胞内。4、制备原