荧光原位杂交FISH实验步骤与方法

帅实验步骤—、实验仪器：荧光显微镜：高速离心机：可达12000r/min高压灭菌锅：160°C以上杀菌恒温箱：为杂交提供恒左温度恒温水浴锅照相机(与荧光显微镜配套)：荧光捕捉图片二、试剂的配制：1、 0.2mol/L(pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB)试剂为NaHfOo•2HoO和Na：HPO；-12比0。 0.2M的NalLPO,溶液：31.2gNalLPO,・2H：0,加蒸馅水lOOOmL溶解 0.2M的NazHPO,溶液：71.632gNaJlPO,-12比0加蒸憾水至1000ml溶解-一-0.2M(pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB):19ml的NaHoPO,溶液和81ml的Na：HPO,溶液充分混合高压灭菌，常温保存。2、 0.03mol/L磷酸盐缓冲溶液((PBS)试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB 0.03MPBS溶液：22.8gNaCl,150ml磷酸缓冲溶液(PB),加蒸馅水至1000ml,混匀 0.02MPBS溶液:取100ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馅水稀释至150ml0.01MPBS溶液：取50ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中，加蒸馅水稀释至150ml高压灭菌，常温保存。3、 4%多聚甲醛溶液(1000ml)(在通风橱内进行操作)----将略小于2/3体积的水(660ml)加热到50°C, 40吕多聚甲醛pfa,边搅拌边加入到水中，继续保持60°C 1滴2mol/LNaOH溶液，立即澄清，但仍有小颗粒。 1/3体积的PBS溶液，用氐1将尸11调至7.2，定容， 用孔径为0.22Pm的滤膜过滤，一一4°C保存最多保存两天，或者取少量保存在-20aC»(加热时温度不宜过高，为60°C-65°C,否则PFA容易降解，配置好后应尽快使用，否则固定效果较差)。4、 lmol几(pH8.O)Tris-HCl缓冲液的配置一-121.lgTris(三疑基氨基甲烷)，加800mL蒸憎水溶解，加入大约42mL的浓HC1-一用1M的HC1或1M的NaOH将pH调至8.0,最后加蒸憾水至1000M1高压灭菌，4°C冰箱保存。5、 10%SDS—10gSDS(十二烷基硫酸钠)于50ml火菌水中，加水至100ml，分装后室温保存。火菌，或用滤膜过滤

称取SDS时需戴口罩！6、 0.5MEDTA（pH8.0）溶液的配置一一186.Ig乙二胺四乙酸二钠加800mL蒸馅水溶解，剧烈搅拌（最好使用磁力搅拌机）用NaOH调节溶液的pH至&0,然后定容至lOOOmLo7、 杂交缓冲液£

152025100200300400500配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中，各试剂的加入顺序：£

152025100200300400500360uL5MNaCl：40uLlMTris—HC1xuL100%甲酰胺（见下表）yuL2uL无菌水（见下表）10%SDS0.22um孔径的滤膜过滤，4°C保存甲酰胺浓度（％）甲酰胺体积X（UL）无菌水体积y（uL）001598J表1配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水的体积1498139812981198109830600998*35700898.4080079845900698501000598LL口01100498（甲酰胺有剧毒，操作时需戴手套，在通风处内进行，废液需要回收）不同甲酰胺杂交液的配制甲酰胺浓度（%）5MNaCl溶液(mL)IMTris-HCl(mL)10%SDS(mL)甲酰胺体积x（mL）无菌水体积y（mL）207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.6 ]8、杂交后洗涤液的配置配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中，各试剂加入的顺序如下:ZuL5MNaClImLlMTris-HCl（pH7.6）无菌水加至50mL50nL10%SDS

500uLEDTA表2 根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而左的探针清洗液液中NaCl体积数甲酰胺浓度％NaCl体积z(uL)NaCl最终浓度（mM）09000900JL6400640I104600上1532804603282022502252515901593011203580011280.405605645400405028028LL20020不同甲酰胺对应的洗涤液的配制甲酰胺浓度（%）imTris-HCl 10%SDS（mL）0.5MEDTA5MNaCl溶液无菌水体积(mL)(mL)(mL)(mL)2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、 A9,6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid（DAPI）常备：1mgHl-1需要稀释为：1Pgh灭菌储存在-20°C（用铝箔覆盖管子）DAPI可诱变致癌，所以在使用时要戴手套并且收集废液，包括早使用移液管时。为了避免使用时对溶液造成污染，所有的溶液应取出置于50ml管中，够每天使用的量。三、实验步骤：1、玻片的预处理：⑴玻片预处理1）玻片清洗：载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干*争，在实验室可用超声清洗代替刷洗（4〜5次每次10min），然后用清水浸泡过夜；2）硅化处理:第二天换用1%的盐酸浸泡24小时，然后用蒸馅水清洗干净后放入高压灭菌锅火菌，60。C烘干。盖玻片用锡纸包好TC保存备用。（盖玻片干净即可不用处理）（2）黏附剂涂片制备载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液（现配现用）中约lmin,取出用高压灭菌处理过的蒸^留水清洗后于室温下干燥（也町放入烘箱里25。C烘「），然后置4°C保存备用2、 荧光探针的选择和标记（见fish探针的选择表）3、 样品的制备与固定（1） 用已火菌的聚乙烯取样管取反应器内泥水混合液ImL,加适量火菌蒸馅水振荡混匀，并用超声波处理使细菌分散。取处理后的悬浊液约0.5ml进行后续处理。（2） 将悬浊液混合均匀后，按1：1加入4%多聚甲醛，于4°C固定24小时，（3） 然后置于12000r/min离心5min去除固定剂，将固定样本加入lml0.01mol/LPBS以lOOOOr/min的速度离心漂洗两次，弃去上清液。（4） 米用PBS与乙醇的1：1溶液稀释泄容至lml于吃0°C保存备用4、 样品的预处理（1） 用微型振荡器将样品混合均匀，取10口1样品在载玻片上涂抹20mmX20mm大小（不要太大），37C的烘箱热固定2h,最高温度不超过60°C（2） 风干后于50%、80%、95%的乙醇中各脱水3min,自然风干。（脱水:准备三个瓷盘，然后将载玻片取出依次放入瓷盘中！50%乙醇淹没裁玻片脱水3mim取出放入第二、三个瓷盘然后用80%乙割脱水96%乙醇脱水。脱水后魄0%、96倜乙醇回收。）脱水后的玻片可以在室温下保存几个月，可在-209的条件下保存几个月5、 原位杂交探针浓度为50ng/LXL,在密闭的杂交盒内铺满吸水纸（经高压火菌烘干），用杂交液湿润，使杂交环境保持一龙的湿度。用移液枪分别取24UL的杂交液和1PL探针滴入带有样品的载玻片上（均匀覆盖涂片而积），（加盖硅化盖玻片，不用）放入杂交盒内进行杂交反应。杂交温度与杂交时间如下。所有有关探出t的操作在处理时都应避光处理！探针种类温度（’C时间（h）甲酰胺浓度％备注EUBMIX46L20同步染色法AOBMIX46—355重复染色法NOBMIX46510重复染色法GAOMIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PA0651462.530同步染色法6、 杂交后洗涤从恒温箱中取出玻片之前将盛有清洗液的容器放入到48°C的水浴中预热20分钟。杂交完成后取出玻片，立即放入到预热好的容器中。注意不能让玻片干燥，不然将很难洗去非特异性结合的信号，增加背景染色。清洗液的量应当淹没玻片，清洗1520分钟后取出，用清水洗去剩余的清洗液，然后室温下晾干。7、 DAPI染色每个玻片用10ULDAPI（用甲醇稀释至lUg/UL）滴加到载玻片样品上，在冰上染色lOmin,用水冲洗多次，室温下自然晾干，镜检前加盖盖玻片。8、荧光显微镜观察经过以上处理的样品，用荧光显微镜进行观察。探针目标菌群探针序列甲酰胺浓度修饰EUB338DomainBacteriaGCTGCCTCCCGTAGGAGT20%HEXNS0190AmmoniaKoxidizingbacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3Nitrite^oxidizingbacteriaCCTGTGCTCCATGCTCCG40%FITCcNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGAOQ989CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5™HGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPA0651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3™DenitrifierCGGGAGGCAGCAGT35%FAM注：。探针浓度均为50ng/uL：bcNIT3为硝酸菌探针门T3的竞争探针。AbbreviationmaximumabsorptionMaximumemissionFiltersetFITC（绿色）492nm528nm10(Zeiss)DAPI（蓝色）365nm418nm02(Zeiss)CY3（橙色/红色）554nm570nm15(Zeiss)CY5（红外线检测）650nm667nm26(Zeiss)HEX探针的选用选用EUBMIX（EUB338.EUB338II、EUB338III）来检测活性污泥中的全部的细菌匚选用PAOMIX来检测活性污泥中的聚磷菌，选用AOBMIXNOBMIX来检测活性污泥中的硝化菌。选用GAOMIX探针来检测活性污泥中的聚糖菌，选用HGC69a探针来检测反硝化聚磷菌的优势菌种Actinobacteria,用PA0651来检测优势菌种Rhodocyclust杂交后用