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文档简介
帅实验步骤—、实验仪器:荧光显微镜:高速离心机:可达12000r/min高压灭菌锅:160°C以上杀菌恒温箱:为杂交提供恒左温度恒温水浴锅照相机(与荧光显微镜配套):荧光捕捉图片二、试剂的配制:1、 0.2mol/L(pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB)试剂为NaHfOo•2HoO和Na:HPO;-12比0。 0.2M的NalLPO,溶液:31.2gNalLPO,・2H:0,加蒸馅水lOOOmL溶解 0.2M的NazHPO,溶液:71.632gNaJlPO,-12比0加蒸憾水至1000ml溶解-一-0.2M(pH7.4)磷酸缓冲溶液(PB):19ml的NaHoPO,溶液和81ml的Na:HPO,溶液充分混合高压灭菌,常温保存。2、 0.03mol/L磷酸盐缓冲溶液((PBS)试剂为NaCl和磷酸缓冲溶液PB 0.03MPBS溶液:22.8gNaCl,150ml磷酸缓冲溶液(PB),加蒸馅水至1000ml,混匀 0.02MPBS溶液:取100ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中,加蒸馅水稀释至150ml0.01MPBS溶液:取50ml0.03MPBS溶液至150ml容量瓶中,加蒸馅水稀释至150ml高压灭菌,常温保存。3、 4%多聚甲醛溶液(1000ml)(在通风橱内进行操作)----将略小于2/3体积的水(660ml)加热到50°C, 40吕多聚甲醛pfa,边搅拌边加入到水中,继续保持60°C 1滴2mol/LNaOH溶液,立即澄清,但仍有小颗粒。 1/3体积的PBS溶液,用氐1将尸11调至7.2,定容, 用孔径为0.22Pm的滤膜过滤,一一4°C保存最多保存两天,或者取少量保存在-20aC»(加热时温度不宜过高,为60°C-65°C,否则PFA容易降解,配置好后应尽快使用,否则固定效果较差)。4、 lmol几(pH8.O)Tris-HCl缓冲液的配置一-121.lgTris(三疑基氨基甲烷),加800mL蒸憎水溶解,加入大约42mL的浓HC1-一用1M的HC1或1M的NaOH将pH调至8.0,最后加蒸憾水至1000M1高压灭菌,4°C冰箱保存。5、 10%SDS—10gSDS(十二烷基硫酸钠)于50ml火菌水中,加水至100ml,分装后室温保存。火菌,或用滤膜过滤
称取SDS时需戴口罩!6、 0.5MEDTA(pH8.0)溶液的配置一一186.Ig乙二胺四乙酸二钠加800mL蒸馅水溶解,剧烈搅拌(最好使用磁力搅拌机)用NaOH调节溶液的pH至&0,然后定容至lOOOmLo7、 杂交缓冲液£
152025100200300400500配置2ml杂交缓冲液于2ml离心管中,各试剂的加入顺序:£
152025100200300400500360uL5MNaCl:40uLlMTris—HC1xuL100%甲酰胺(见下表)yuL2uL无菌水(见下表)10%SDS0.22um孔径的滤膜过滤,4°C保存甲酰胺浓度(%)甲酰胺体积X(UL)无菌水体积y(uL)001598J表1配置不同甲酰胺杂交液中甲酰胺和无菌水的体积1498139812981198109830600998*35700898.4080079845900698501000598LL口01100498(甲酰胺有剧毒,操作时需戴手套,在通风处内进行,废液需要回收)不同甲酰胺杂交液的配制甲酰胺浓度(%)5MNaCl溶液(mL)IMTris-HCl(mL)10%SDS(mL)甲酰胺体积x(mL)无菌水体积y(mL)207280.480239.6357280.4140179.6407280.4160159.6557280.422099.6 ]8、杂交后洗涤液的配置配制50mL杂交洗涤液于50mL离心管中,各试剂加入的顺序如下:ZuL5MNaClImLlMTris-HCl(pH7.6)无菌水加至50mL50nL10%SDS
500uLEDTA表2 根据杂交缓冲液中甲酰胺浓度而左的探针清洗液液中NaCl体积数甲酰胺浓度%NaCl体积z(uL)NaCl最终浓度(mM)09000900JL6400640I104600上1532804603282022502252515901593011203580011280.405605645400405028028LL20020不同甲酰胺对应的洗涤液的配制甲酰胺浓度(%)imTris-HCl 10%SDS(mL)0.5MEDTA5MNaCl溶液无菌水体积(mL)(mL)(mL)(mL)2080.4418369.63580.446.4381.24080.444.48383.125580.441.63869、 A9,6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid(DAPI)常备:1mgHl-1需要稀释为:1Pgh灭菌储存在-20°C(用铝箔覆盖管子)DAPI可诱变致癌,所以在使用时要戴手套并且收集废液,包括早使用移液管时。为了避免使用时对溶液造成污染,所有的溶液应取出置于50ml管中,够每天使用的量。三、实验步骤:1、玻片的预处理:⑴玻片预处理1)玻片清洗:载玻片与盖玻片用热肥皂水刷洗干*争,在实验室可用超声清洗代替刷洗(4〜5次每次10min),然后用清水浸泡过夜;2)硅化处理:第二天换用1%的盐酸浸泡24小时,然后用蒸馅水清洗干净后放入高压灭菌锅火菌,60。C烘干。盖玻片用锡纸包好TC保存备用。(盖玻片干净即可不用处理)(2)黏附剂涂片制备载玻片放入APES与丙酮的1:50溶液(现配现用)中约lmin,取出用高压灭菌处理过的蒸^留水清洗后于室温下干燥(也町放入烘箱里25。C烘「),然后置4°C保存备用2、 荧光探针的选择和标记(见fish探针的选择表)3、 样品的制备与固定(1) 用已火菌的聚乙烯取样管取反应器内泥水混合液ImL,加适量火菌蒸馅水振荡混匀,并用超声波处理使细菌分散。取处理后的悬浊液约0.5ml进行后续处理。(2) 将悬浊液混合均匀后,按1:1加入4%多聚甲醛,于4°C固定24小时,(3) 然后置于12000r/min离心5min去除固定剂,将固定样本加入lml0.01mol/LPBS以lOOOOr/min的速度离心漂洗两次,弃去上清液。(4) 米用PBS与乙醇的1:1溶液稀释泄容至lml于吃0°C保存备用4、 样品的预处理(1) 用微型振荡器将样品混合均匀,取10口1样品在载玻片上涂抹20mmX20mm大小(不要太大),37C的烘箱热固定2h,最高温度不超过60°C(2) 风干后于50%、80%、95%的乙醇中各脱水3min,自然风干。(脱水:准备三个瓷盘,然后将载玻片取出依次放入瓷盘中!50%乙醇淹没裁玻片脱水3mim取出放入第二、三个瓷盘然后用80%乙割脱水96%乙醇脱水。脱水后魄0%、96倜乙醇回收。)脱水后的玻片可以在室温下保存几个月,可在-209的条件下保存几个月5、 原位杂交探针浓度为50ng/LXL,在密闭的杂交盒内铺满吸水纸(经高压火菌烘干),用杂交液湿润,使杂交环境保持一龙的湿度。用移液枪分别取24UL的杂交液和1PL探针滴入带有样品的载玻片上(均匀覆盖涂片而积),(加盖硅化盖玻片,不用)放入杂交盒内进行杂交反应。杂交温度与杂交时间如下。所有有关探出t的操作在处理时都应避光处理!探针种类温度(’C时间(h)甲酰胺浓度%备注EUBMIX46L20同步染色法AOBMIX46—355重复染色法NOBMIX46510重复染色法GAOMIX462.530同步染色法HGC69a462.530同步染色法PA0651462.530同步染色法6、 杂交后洗涤从恒温箱中取出玻片之前将盛有清洗液的容器放入到48°C的水浴中预热20分钟。杂交完成后取出玻片,立即放入到预热好的容器中。注意不能让玻片干燥,不然将很难洗去非特异性结合的信号,增加背景染色。清洗液的量应当淹没玻片,清洗1520分钟后取出,用清水洗去剩余的清洗液,然后室温下晾干。7、 DAPI染色每个玻片用10ULDAPI(用甲醇稀释至lUg/UL)滴加到载玻片样品上,在冰上染色lOmin,用水冲洗多次,室温下自然晾干,镜检前加盖盖玻片。8、荧光显微镜观察经过以上处理的样品,用荧光显微镜进行观察。探针目标菌群探针序列甲酰胺浓度修饰EUB338DomainBacteriaGCTGCCTCCCGTAGGAGT20%HEXNS0190AmmoniaKoxidizingbacteriaCGATCCCCTGCTTTTCTCC55%HEXNIT3Nitrite^oxidizingbacteriaCCTGTGCTCCATGCTCCG40%FITCcNIT3bCCTGTGCTCCAGGCTCCGGAOQ989CompetibacterTTCCCCGGATGTCAAGGC35%Cy5™HGC69aActinobacteriaTATAGTTACCACCGCCGT25%FITCPA0651AccumulibacterCCCTCTGCCAAACTCCAG35%Cy3™DenitrifierCGGGAGGCAGCAGT35%FAM注:。探针浓度均为50ng/uL:bcNIT3为硝酸菌探针门T3的竞争探针。AbbreviationmaximumabsorptionMaximumemissionFiltersetFITC(绿色)492nm528nm10(Zeiss)DAPI(蓝色)365nm418nm02(Zeiss)CY3(橙色/红色)554nm570nm15(Zeiss)CY5(红外线检测)650nm667nm26(Zeiss)HEX探针的选用选用EUBMIX(EUB338.EUB338II、EUB338III)来检测活性污泥中的全部的细菌匚选用PAOMIX来检测活性污泥中的聚磷菌,选用AOBMIXNOBMIX来检测活性污泥中的硝化菌。选用GAOMIX探针来检测活性污泥中的聚糖菌,选用HGC69a探针来检测反硝化聚磷菌的优势菌种Actinobacteria,用PA0651来检测优势菌种Rhodocyclust杂交后用
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