植酸测定方法的比较

植酸测定方法的比较

植物酸，也被称为“六醇六磷酸”，由c6h184p6（ip6）代谢。广泛分布于谷物、豆类、干果、蔬菜、水果中。这些食物中的含量高于大豆、谷物丝和玉米。植酸分子中具有能同金属配合的24个氧原子、12个羟基和6个磷酸基,是一种少见的金属多齿螯合剂。因此植酸可在食品工业、日化工业、医学、纺织工业、金属加工与防护业及其它工业中作食品添加剂、抗龋齿剂、发酵促进剂、防变色剂、抗氧剂、防腐剂、发酵促进剂、络合剂等。同时植酸的抗营养特性和6个具有强解离质子的邻位磷酸基团的强络合特性,影响了单胃畜禽(猪、鸡)等对饲料中蛋白质、钙、磷、锌、锰以及碳水化合物、脂肪的利用与吸收。而大量摄食小麦、大豆等植酸含量较高的谷物产品,被认为是发展中国家人群中普遍存在的铁、锌缺乏病症的主要原因之一。因植酸的上述作用,就使得工业和科研中对植酸进行定性分析与定量检测变得尤为重要。1定性分析和定量检测植酸的提取和分离主要是将植酸从待检样品中提取并使之与样品中其他成分分离,为进一步进行定性分析或定量检测奠定基础。植酸的提取原理是利用其可溶于稀酸溶液的特性进行的。目前提取用的稀酸主要是盐酸(HCl)和三氯乙酸(TCA)。1.1离心药品提取称取过筛样品加入1.2%HCl·10%Na2SO4溶液于室温下搅拌浸提2h,4000r/min离心30min,取上清液于4℃冰箱中备用。用此种提取方法不但耗时,每个样品仅提取就需要2h,而且对提取药品的用量也非常大,每个样品至少要提取液40mL。但优点是不需要借助仪器设备,只要三角瓶就可进行,操作简单易行。1.2粗提植酸溶液的制备称取粉碎后过筛样品放入圆柱形滤纸筒中,滤纸直径小于索氏提取器的内径,其下端用细绳扎紧,其高度不得高于索氏提取器外侧的虹吸管,加入一定量的浸提液于圆底烧瓶中,连接索氏提取器,提取一定时间后转入蒸馏装置回收粗提植酸样品。此种方法耗时一般为3h,且药品用量一般为100mL以上,同样是费时费力,但提取率可达50%以上,且通过蒸馏装置可以回收提取液。1.3超声提取法称取粉碎后过筛样品加入浸提液至设定容量,后置超声波细胞破碎器探头于烧杯中深约3cm,设定功率、时间,进行超声波处理。处理结束后,高速离心(8000r/min)20min,倒出上清液。采用超声探头振荡提取,大大缩短了提取的时间,由传统的浸提2~3h缩短为1~3min,也使植酸的大量检测成为可能。但可能因超声波法振荡提取的时间较短,提取液混合不够充分,导致其提取率只有45%左右,提取效率没有索氏提取法高。1.4ase快速萃取萃取液这种技术的原理是将样品溶液在加温(50~200℃)、加压(1500~2000Pa)的条件下用ASE快速萃取液进行快速萃取。加速溶剂萃取(ASE萃取)与传统萃取相比具有耗时短,溶剂用量少等优点。但由于其设备昂贵,并不能普遍应用。2除杂剂的制备植酸的纯化主要是去除粗提液中的杂质,通常可用离心、冷冻、解冻、沉淀法、交换柱分离、蒸发等方法去除。这些方法的主要目的是沉淀分离植酸类物质,沉降或者置换凝胶物质、可溶性蛋白质及无机磷,浓缩肌醇磷酸酯。2.1离子交换树脂法测定植酸含量离子交换树脂法纯化植酸是根据植酸易溶于稀酸的特性,用稀酸将植酸从制备好的样品中提取出来,经过离心和离子交换树脂使植酸与杂质分离。此法首先要选择适当的树脂,可以是硅胶阴离子交换剂SAX、季铵型聚苯乙烯(氯型)树脂、阴离子交换树脂AG1-X8或201×8型强碱性阴离子交换树脂。离子交换树脂法测定样品中植酸含量的原理是样品提取液中植酸及其前体(从一磷酸肌醇到五磷酸肌醇)都可被阴离子树脂吸附,并可被一定浓度的NaCl溶液洗脱,然后通过测定洗脱液中无机磷来测定植酸含量。树脂需经过低浓度食盐浸泡后上柱,再用水洗至无盐状态,备用。一般用国外树脂的提取效果要好,但价格昂贵。国产的像季铵型聚苯乙烯(氯型)树脂和201×8型强碱性阴离子树脂(氯型)现在也取得了较好的结果,回收率较高,重现性较好。阴离子树脂法测定样品中植酸的缺点是费时、操作较繁锁。不同浓度的溶液洗脱会有多次循环,同时如果树脂太细时,洗脱需加压,并要控制洗脱速度。2.2蒸发+洗脱液经过离子交换树脂法纯化后可以有效地浓缩肌醇磷酸酯、去除无机磷及大部分杂质。通过蒸发去除提取液和洗脱液中的HCl,否则,大量氢离子和氯离子的存在会干扰定量检测结果。由以上两步的分离纯化后,就可以将植酸提取液进行直接的定量分析。3植酸及排酸分子的确定1872年Preffer首次发现植酸,1912年Anderson确定其分子结构,1914年Henhuer和Stadler首次建立了植酸分析的铁沉淀法。至今测定植酸的方法已经衍生出了多种,但不同的测定方法有其适用性,且测定方法的不同会导致不同的回收率。3.1不同植物条件下植物酸的适用性3.1.1植物酸间接测定的适用性(1)无机磷突变体的筛选由于植酸含量的下降一般都伴随着无机磷含量的升高,而总磷含量维持不变,因此由无机磷的含量就可以间接地反映出样品中的植酸含量。王雪艳等用本方法来对玉米低植酸突变体进行筛选,通过筛选高无机磷(HIP)突变体来获得低植酸突变体。因此,在进行低植酸作物突变体的筛选工作时,可采用间接测定法进行。(2)标准曲线和方法检出限吕杰等运用该法可以测定植酸的线性范围为0~20μg/mL,相关系数为0.9996,植酸检出限为0.144μg/mL,相对标准偏差为1.1%~6.6%。该法与消化测磷法的测定结果比较,差异无显著性。该法操作简便快速,结果准确可靠,便于推广应用。(3)实际耗用硫代硫酸钠摩尔数法其原理为植酸与硫酸铜反应生成植酸铜沉淀。多余的硫酸铜与碘化钾反应析出游离碘,用硫代硫酸钠标准溶液滴定,根据耗用硫代硫酸钠的摩尔数,计算出实际耗用的硫酸铜溶液的摩尔数,然后计算出试样中的植酸含量。用硫酸铜—碘量法操作简便、重复性好、准确性较高。3.1.2植酸含量检测方法(1)用双吡啶直接定量测定样品中植酸含量。由样品与双吡啶巯基乙酸反应在519nm条件下吸光度值换算出植酸的含量。此方法植酸钠含量在600μg以内呈线性关系。(2)比色法依据是通过植酸与三价铁的定量反应,以及过量铁与磺基水杨酸的显色反应来测定植酸含量的。分步显色法其分析一个样品所需时间不到30min,工作效率比沉淀消化法提高了十几倍。比色法测定植酸由于所用时间大为节省,所用仪器比较简单且常见,分析结果与HPLC基本一致,故此法是目前测定植酸含量的常用分析方法。(3)高效液相色谱(HPLC)测定植酸是由植酸样品溶液通过0.45μm醋酸纤维膜过滤,用10μL微量注射器吸取一定量滤液,直接注入高效液相色谱仪测定。于254nm波长处测出植酸色谱峰的面积,由植酸标准曲线查出植酸含量。采用HPLC法可以将样品中IP6及其部分降解产物(IP3~IP5)分离并定量测量。HPLC法一般是科研上用来对植酸产品进行准确测定时所用的方法。(4)近红外反射光谱法(NIRS)。原理是在样品具有相当厚度的情况下,用近红外光照射,样品透射光可忽略不计,入射光主要被样品吸收或被样品反射,样品在近红外区不同波长处便会产生相应的光密度值,其大小与样品中植酸磷含量相关。NIRS在测定样品前只需对样品进行粉碎处理,应用相应定标软件,便可测定成批样品的植酸磷含量。1990年Parrish等人首次用近红外反射法测定了棉花籽粒中的植酸。由于此法具有快速简便、相对准确的优点,且不需化学试剂,分析样品不损失,因此它将成为快速实施检测的先导技术。(5)毛细管等速电泳法(CITP)。Blatny等运用CITP及传导性检测的方法观察植酸水解产物与时间的关系,发现采用两种不同的缓冲系时,ITP是一种快速、简便的定量检测IP~IP6及正磷酸盐的方法。(6)31P-核磁共振(NMR)法可用来检测IP6及其降解产物,并可同时确定磷酸根的位置。31P-NMR法在检测植物组织中的IP6及其立体形状,与其他成分如Cu2+,Zn2+等离子的连接状态时非常适用。这种方法有一定的准确性及特异性,但设备昂贵,而且灵敏度较低,因此不能用来检测低浓度的肌醇磷酸酯。3.2氯化铁—不同测定方法的回收率武雪芬等利用植酸对磺基水杨酸铁的脱色作用比色法测定植酸的回收率,当待测植酸浓度为0.1515×10-3~0.1515×10-5mol/L(即0.1‰~0.001‰),该法平均回收率为100.67%。廖明星等利用离子交换树脂提取植酸,加入三氯化铁—磺基水杨酸显色法测定植酸,两次的加标回收率达98%以上,测定的重复性<5%。褚西宁等用双吡啶直接定量测定样品中植酸含量,添加三种不同量植酸钠内标的平均回收率为95%左右。蒋建军用钒钼黄比色法测定植酸含量的内标回收率在98%~104%之间。4问题和视角4.1提取-纯化法虽然现在对植酸的测定方法有很多种,但还是没有统一的检测标准。沉淀法虽然操作简单,而且仪器要求不高,但一是对滴定终点不好掌握,需要操作者有极为丰富的经验,二是实际操作中发现这对样品中植酸含量有很大的限制性,当植酸含量过高会因为褪色太明显影响比色的结果或者分光光度计无法显示,而植酸含量过低的话则会因为提取和纯化时会损失很大,影响最终的结果。离子交换法对使用树脂的要求较高,且洗脱的过程要经过几次,操作繁琐。特别是提取液中的氯离子对测定的结果干扰很大,但回收率和结果较理想。高效液相色谱法操作简便,它将植酸的提纯与测定同时进行,准确度及灵敏度高,但设备及标准物价格昂贵。近红外反射光谱法、31P-核磁共振(NMR)法等都是设备极为昂贵,目前都无法推广应用。毛细管等速电泳法的灵敏度相对较低,还需改进浓缩技术。4.2近红外反射光谱法植酸检测方法今后将会分为更具体,针对不同的研究目的采用不同的快速有效的检测方法。用高效液相色谱法和近红外反射光谱法是最为可靠的两种方法。当对植酸的分子结构进行定性分析时用高效液相色谱法最为有效,它将提纯与测定同步进行,为大量样品的检测提供了保证。而近红外反射光谱法整个过程中不用浪费化学