基因工程的基本操作程序 课件 2022-2023学年高二上学期生物人教版选择性必修3

理论基础DNA是遗传物质的证明DNA双螺旋结构和中心法则的确立遗传密码的破译技术保障基因工程工具的发现和应用

限制性核酸内切酶

DNA连接酶基因载体(如质粒)一、基因工程的诞生和发展二、基因工程的概念

基因工程是指在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，使重组基因在受体细胞中表达，产生出人类所需要的基因产物的技术。基因工程又称DNA重组技术。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平原理基本过程结果DNA重组技术体外基因DNA分子水平基因重组剪切→拼接→导入→表达人类需要的基因产物优点定向改造生物性状克服远缘杂交不亲和障碍，育种周期短（一）限制性核酸内切酶（简称限制酶）能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。含义：主要从原核生物中分离得到来源：磷酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键

作用部位：有专一性(特异性)。即一种限制酶只能识别一种特定核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。作用特点：产生黏性未端、平末端

作用结果：小结识别序列长度：大多数是6个核苷酸序列三、基因工程的工具（二）DNA连接酶——“分子缝合针”1.作用：CGGCCGTTAAAATTGCTATA具有相同黏性末端的两个DNA片段连接起来，形成重组DNA分子。3.结果：

将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键（无特异性）。2.实质/作用原理：催化磷酸二酯键的形成DNA连接酶与DNA聚合酶的比较DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象

作用结果 用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要模板需要DNA的一条链为模板形成完整的DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制只能将单个脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键1.作用：2.种类：（三）基因进入细胞的载体——分子运输车作为运载工具，将外源基因送入受体细胞。质粒（最常用）、λ噬菌体的衍生物和某些动植物病毒3.条件：⑴能在宿主细胞内自我复制并稳定地保存⑵有一个或多个限制酶切点，可使外源基因插入其中⑶具有某些遗传标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。⑷对受体细胞无害

(5)大小适宜

实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。基因工程的基本操作程序基因工程Thebasicoperatingproceduresofgeneticengineeringy从社会中来Fromsociety普通棉花转基因抗虫棉将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因转入普通棉花我国是棉花的生产和消费大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。如何能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种呢？从社会中来Fromsociety培育转基因抗虫棉的简要过程苏云金杆菌

普通棉花（无抗虫特性）

棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入与载体拼接重组DNA分子1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测与鉴定Bt基因基因工程的实施过程获取目的基因构建基因表达载体导入目的基因检测和鉴定目的基因一、获得目的基因人们感兴趣而需要的特定基因，也叫外源基因。2.获取目的基因的方法：①从基因文库中获取②利用PCR技术扩增

③人工合成1.目的基因：基因较小，核苷酸序列已知基因通常是有遗传效应的DNA片段AgeneisusuallyapieceofDNAthathasageneticeffectDNA片段基因1基因2基因3放大非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游编码区：能转录相应的mRNA，进一步编码（翻译）出蛋白质的DNA区段。非编码区：不能转录为相应的mRNA，不能编码蛋白质的区段。原核细胞的基因结构(补充内容）非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞基因结构②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子真核细胞的基因结构（补充内容）编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列①不编码蛋白质。②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子编码区非编码区非编码区启动子信使RNA成熟的信使RNA终止子转录剪切拼接翻译蛋白质反转录法构建的真核生物的CDNA文库里不含启动子和终止子真核细胞基因编码区中的内含子不编码蛋白质，但表达时是否转录？将此mRNA逆转录合成DNA，那么合成的这个DNA与原来的DNA是否一样？1、从基因文库中获取（1）基因文库的概念:

先用酶切等方法将某种生物细胞的整个基因组DNA片段切割成大小合适的片段，再将这些片段分别与载体连接起来,导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库（2）

基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部

分基因，如：cDNA文库基因组文库VScDNA文库基因组文库文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少物种间基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以基因组文库中的真核基因含有内含子，而原核细胞没有内含子剪切系统，所以基因组文库中的真核基因不易在原核细胞中正常表达。动植物细胞的内含子剪切系统也有差异，所以动物基因组文库中的基因不易在植物细胞中正常表达，反之亦然。思考、为什么基因组文库中只有部分基因可以在物种间进行基因交流？例题：下列关于cDNA文库和基因组文库的说法中，不正确的是

(

)A．cDNA文库中只含有某种生物的部分基因，基因组文库中含有某种生物的全部基因B．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同C．cDNA文库中的基因没有启动子D．一种生物的cDNA文库可以有许多种，但基因组文库只有一种B2、利用PCR技术扩增PCR简介

1.概念：PCR全称为_______________，

是一项在生物__复制____

_______的核酸合成技术聚合酶链式反应体外特定DNA片段2.原理：利用

的原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制，使其数量呈

方式增加。DNA双链复制指数PCR技术—聚合酶链式反应3.过程变性退火延伸_____________________目的基因的筛选与获取——PCR的过程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR第1步：变性5

′-3

′--3

′-5

′5

′-3

′--3

′-5

′当温度为94℃时，双链DNA解旋为单链。5

′--3

′-5

′3

′-第2步：复性当温度下降到55℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。目的基因的筛选与获取——PCR的过程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR5

′--3

′-5

′3

′-第2步：复性什么是引物？为什么需要引物？

引物是一小段能与DNA母链的一小段碱基序列互补配对的短单链核酸。DNA双链解旋之后DNA聚合酶只能从DNA的3’端开始延伸DNA链，并不能从头合成DNA，所以需要引物先结合上去，提供3’端。

由于DNA双链是反向平行的，所以需要2种引物。目的基因的筛选与获取——PCR的过程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR5

′--3

′-5

′3

′-第3步：延伸5

′--3

′-5

′3

′-5

′--3

′-5

′3

′-当温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。目的基因的筛选与获取——PCR的过程Screeningandacquisitionoftargetgenes——TheprocessofPCR第一轮循环的产物作为第二轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环产物。5′--3′3′-5’3′--5′5′--3′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′第二轮循环的产物作为第三轮反应模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环产物。5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’变性（解旋为单链）退火（引物与单链互补结合）延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环3.过程聚合酶链式反应——过程归纳Polymerasechainreaction——Theprocessofinduction4.条件①____：模板DNA(需含有目的基因)。②____：一小段DNA或RNA，能与模板DNA的一段碱基序列互补配对。③原料：A、T、G、C四种__________。(dNTP)

④酶：

酶。⑤其他条件：需要一定的

溶液（一般添加Mg2+）。模板引物脱氧核苷酸耐高温的DNA聚合缓冲Taq酶激活剂5.前提：一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。6.结果：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。DNA在体内的半保留复制

条件：模板、原料、能量、酶

模板：DNA的两条链（母链）

原料：四种游离的脱氧核苷酸

能量：一般由ATP

酶：解旋酶、DNA聚合酶

特点：半保留复制、边解旋边复制复习：细胞内DNA复制PCR和DNA的体内复制是否完全相同？PCR技术DNA复制原则原料条件解旋方式场所酶特点结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、引物、酶等DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋体外主要在细核胞内热稳定的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶短时间内形成大量的DNA片段形成完整的DNA分子PCR技术扩增与细胞中DNA复制的比较半保留复制、全解旋再复制半保留复制、边解旋边复制

在80-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开。

当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。PCR技术中，解开双链没有用解旋酶，而是利用的DNA的热变性和复性的原理。变性：复性：目的基因的筛选与获取Screeningandacquisitionoftargetgenes3.人工合成法（1）前提：（2）方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因目的基因的筛选与获取——人工合成DNA目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成反转录法：根据已知的氨基酸序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成归纳3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_________________获取目的基因的三种方法1、如果知道目的基因两端的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用____________

2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用________________PCR技术扩增化学方法人工合成构建基因文库，再从基因文库中获取1、PCR技术是一种DNA的扩增技术。在一定条件下，加入模板DNA、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以实现DNA的扩增。据此判断不合理的是

（

）

A．dATP在DNA扩增中可以提供能量，同时作DNA合成的原料B．dTTP完全水解后产物有胸腺嘧啶、磷酸、核糖C．DNA扩增过程未加解旋酶，可以通过先适当加温的方法破坏氢键，使模板DNA解旋D．CTP水解脱去两个磷酸基后是组成RNA的基本单位之一

B例题2、下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D例题3、下列有关PCR技术的说法，不正确的是

(

)A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术B．PCR技术的原理是DNA双链复制C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列D．PCR扩增中需要解旋酶解开双链DNAD例题4、下列有关获取目的基因方法的叙述，错误的是(

)A．直接分离目的基因的方法的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性B．由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法C．目前人工合成基因的方法主要有两种，分别是反转录法和化学合成法D．PCR技术的原理是DNA复制，需要RNA聚合酶催化DNA合成D步骤获取目的基因构建基因表达载体(核心)导入目的基因检测和鉴定目的基因1.2.3.4.1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。2组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因等构建基因表达载体——核心步骤启动子首端RNA聚合酶转录终止子尾端RNA聚合酶转录标记目的基因基因表达载体的组成：一般用同一种

酶分别切割载体和目的基因，再用

酶把两者连接(如图)。限制DNA连接基因表达载体的构建过程：缺点1：质粒自身环化。abcd限制酶切割DNA连接酶连接DNA连接酶连接【讨论】如果只用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？a、b、c、d四个黏性末端相同。思考分析——单酶切的缺点Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestion缺点2：目的基因自身环化。abcd限制酶切割DNA连接酶连接DNA连接酶连接思考分析——单酶切的缺点Thinkinganalysis——Disadvantagesofsingleenzymedigestionabcd限制酶切割DNA连接酶连接反向连接重组DNA缺点3：目的基因与质粒反向连接，造成目的基因不能正确表达。思考分析——双酶切用两种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段重组质粒限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd黏性末端a与c相同；黏性末端b与d相同。思考分析——双酶切Thinkinganalysis——Doubleenzyme限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA连接酶连接abcd质粒不会重新环化目的基因不会被环化优点1优点2优点3目的基因与质粒不会发生反向连接确保目的基因与运载体定向连接，减少重组杂物。习题巩固——用限制酶切割时需注意的事项Exercisestoconsolidate——Pointsneedingattentionwhencuttingwithrestrictionenzyme(1)获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是为了

。但是使用该法缺点是容易发生

以及

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。产生相同的黏性末端，便于连接目的基因与质粒反向连接目的基因、质粒的自身环化分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体(2)获取一个目的基因需限制酶切割

次,

共产生

个游离的磷酸基团。两4习题巩固——用限制酶切割时需注意的事项Exercisestoconsolidate——Pointsneedingattentionwhencuttingwithrestrictionenzyme(3)选择限制酶切割位点的基本原则：①切割目的基因时：

。②切割质粒时：

。能切下目的基因且不破坏目的基因至少保留一个完整的标记基因，便于筛选基因表达载体的构建Constructionofgeneexpressionvector1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，

错误的是(

)A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量D.二者遵循的碱基互补配对原则相同B基因表达载体的构建Constructionofgeneexpressionvector2.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是()A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别A步骤获取目的基因构建基因表达载体导入目的基因检测和鉴定目的基因1.2.3.4.(三)将目的基因导入受体细胞（一）受体细胞：动物细胞、植物细胞、微生物细胞（大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等）。（二）方法：(三)将目的基因导入受体细胞①农杆菌转化法：将目的基因导入

和裸子植物时最常用的方法。双子叶植物1.导入植物细胞（二）方法：a.土壤农杆菌的特点：植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的

化合物，吸引农杆菌侵染，其

质粒上的

(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的

上。

酚类TiT-DNA染色体的DNAb.方法步骤：

插入Ti质粒的

上→转入

→导入植物细胞→目的基因插入植物细胞中的

上→目的基因表达。目的基因T-DNA农杆菌染色体的DNA核心归纳1.农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。②基因枪法：将目的基因导入

植物常用的方法。表达载体DNA包裹在微小的金粉粒子或钨粉粒子表面→用基因枪高速射入_________或组织中→目的基因表达。单子叶受体细胞③花粉管通道法：在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助

进入受体细胞。花粉管通道植物的体细胞花粉卵细胞精子花粉管子房壁（1）番茄为什么通常容易软化？抗软化番茄的抗软化机理是什么？抗软化番茄的培育

（2）在该项目中，目的基因是什么？其载体是什么？（3）该培育过程运用到哪些生物学技术？2.将目的基因导入动物细胞3.将目的基因导入微生物细胞①方法：感受态细胞转化法（Ca2+处理法）②受体细胞：常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。优点：繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性这种细胞称为感受态细胞③过程：感受态细胞和重组表达载体DNA分子在

中混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子。缓冲液受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、花粉管通道法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T­DNA上↓转入农杆菌中↓导入植物细胞↓整合到受体细胞的DNA上提纯含目的基因的表达载体↓显微注射↓受精卵发育↓具有新性状的个体Ca2＋处理细胞↓感受态细胞↓基因表达载体与感受态细胞混合↓感受态细胞吸收DNA分子①②③方法：利用标记基因（抗生素抗性基因）进行筛选。筛选含有目的基因的受体细胞步骤获取目的基因构建基因表达载体(核心)导入目的基因检测和鉴定目的基因1.2.3.4.(1)检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中：