细菌及细菌类疾病的实验室诊断-动物细菌病的实验室诊断方法（动物微生物技术课件）

动物微生物应用技术动物细菌病的实验室诊断方法

初诊：根据流行病学、症状、病变等方面的疾病特征，做出初步诊断。通过实验室诊断，确定病原是否是细菌以及病原菌的类型。实验室诊断是在临床诊断的基础上进行的病料的采集、保存和运送细菌的形态学检查——涂片镜检细菌的分离培养生化检测血清学试验动物试验分子生物学技术基本程序一、细菌性病料的采集、保存与送检标本采集的一般原则无菌采集，应无污染，严格进行无菌操作。注意在不同病程采集不同部位标本，采集量不应过少。。病程早期、急性期或症状典型时，使用抗生素前。采集的标本必须新鲜，采集后尽快送检。送检过程中，多数菌冷藏运输。采集标本时要防止传播和自身感染。一、细菌性病料的采集、保存与送检防止污染动物剖检个人防护和消毒动物尸体处理废弃物处理一、细菌性病料的采集、保存与送检动物剖检剖检场所：应选择便于消毒、不渗水的解剖地点，最好有专门的剖检场所和剖检台。剖检前，动物尸体应浸泡消毒。一、细菌性病料的采集、保存与送检个体防护和消毒做好个人防护：剖检过程中，注意个人防护。剖检后的器械浸泡消毒后洗刷。一、细菌性病料的采集、保存与送检动物尸体的处理动物尸体焚烧炉深埋（投入消毒药）焚烧或深埋：剖检后动物尸体和病料焚烧灭菌或消毒深埋。一、细菌性病料的采集、保存与送检废弃物的处理垃圾直接洗刷处理不当会引起人和动物疫病的散播动物或人的传染病一、细菌性病料的采集、保存与送检无菌采样目的防止病料被污染方法所用器械和器皿必须灭菌点燃酒精灯注意无菌操作一、细菌性病料的采集、保存与送检适时采样细菌丰富增殖时期、病料应该新鲜：取濒死动物或刚死亡的动物。死亡动物采集病料夏天不宜迟于6～8h，冬天不迟于24h。一、细菌性病料的采集、保存与送检适当部位选择病料的部位可采用两个原则第一原则：根据疾病的类型和表现采集病变最典型的部位第二原则：一般采集正常无菌的部位一、细菌性病料的采集、保存与送检实质脏器的采集剖开体腔后，立即采集，置于无菌容器内。污染或剖开过久的被检器官：先烧烙表面，然后在烧烙的深部取一块实质脏器，放在灭菌容器内。如有细菌检验条件，可在剖检后直接做病料的触片染色和细菌的分离培养。一、细菌性病料的采集、保存与送检液体病料的采集脓汁、胸水一般用灭菌的棉棒或吸管吸取放入试管内，塞好棉塞送检。血液可无菌操作从静脉或心脏采血，然后加抗凝剂（每1ml血液加3.8%枸橼酸钠0.1ml）。若需分离血清，则采血后放在灭菌的容器中，摆成斜面，待血液凝固析出血清后，再将血清吸出，置于另一灭菌试管中送检。一、细菌性病料的采集、保存与送检其他病料的采集皮肤要取有病变且带有一部分正常皮肤的部位。被毛或羽毛取病变明显部位，并带毛根放平皿。胎儿可将流产胎儿送往实验室，也可用吸管或注射器吸取胎儿胃内容物放入试管送检。肠道及内容物需选择病变最明显的部分，将其中内容物去掉，用灭菌水轻轻冲洗后放平皿内。一、细菌性病料的采集、保存与送检细菌性病料的保存和送检低温保存尽快送检做好记录畜主姓名、动物种类、地址、发病情况、欲检部位及检验项目、采集时间等。二、细菌的形态学检查—镜检方法光学显微镜检查电子显微镜检查意义观察病料中有无细菌以及细菌的形态、数量、分布、结构、种类等，进行初步判断普通光学显微镜用油镜放大1000倍，一般细菌均能清楚看到。荧光显微镜可看到发射荧光的细菌。还应用于免疫荧光技术中。电子显微镜有透射电子显微镜和扫描电子显微镜。前者适于观察细菌内部超微结构，后者适于对细菌表面结构的观察。二、细菌的形态学检查—镜检不染色细菌标本检查1.主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。可对某些病原菌作出初步鉴定，如霍乱菌。2.螺旋体由于不易着色并有形态特征，故多用不染色标本作暗视野显微镜检查。二、细菌的形态学检查—镜检常用染料分为碱性、酸性、复合染料：碱性染料电离后显色离子带正电荷，易与带负电荷的被染物结合。由于细菌均带负电荷，易与染料结合而着色。常用的有碱性复红、结晶紫、美蓝等。细菌染色标本的检查二、细菌的形态学检查—镜检酸性染料电离后显色离子带负电荷，易与带正电荷的被染物结合。细菌都带有负电荷故不易着色。通常用来染细胞浆，而很少用于细菌的染色。常用的酸性染料有伊红、刚果红等。常用染料细菌染色标本的检查二、细菌的形态学检查—镜检复合染料(中性染料)及荧光染料复合染料是碱性染料和酸性染料的复合物，如瑞氏染料(伊红美蓝)、姬姆萨染料(伊红天青)等；荧光染料如荧光标记的抗体，荧光素常用异硫氢基荧光素。这些染色常用于某些特殊的染色技术中。常用染料细菌染色标本的检查二、细菌的形态学检查—镜检

革兰染色抗酸染色荧光染色常用染色方法细菌染色标本的检查二、细菌的形态学检查—镜检革兰染色最经典、最常用的染色方法。在分离培养前都要进行革兰染色、镜检。分为G+菌和G-菌，可初步识别和鉴定。结果为临床早期诊断及治疗提供依据。可为临床选择用药提供参考，有针对性的治疗方案。常用染色方法细菌染色标本的检查二、细菌的形态学检查—镜检抗酸染色将细菌分为抗酸性和非抗酸性细菌两大类。只用于结核病等检查。抗酸染色的鉴定结果，对疾病的诊断和治疗具有重要参考价值。常用染色方法细菌染色标本的检查二、细菌的形态学检查—镜检敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及志贺菌等的检测。还有：鞭毛染色可观察有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中很重要。异染颗粒染色镜检异染颗粒，为临床早期诊断白喉提供依据。荧光染色常用染色方法细菌染色标本的检查二、细菌的形态学检查—镜检绝大多数细菌在适宜的条件下可以生长，细菌感染性患畜标本只有经过细菌的分离培养、鉴定和药物敏感试验，才可对感染性疾病进行病原学诊断并指导临床用药。因此，细菌培养对疾病的诊断、预防和治疗具有重要的作用。二、细菌的分离培养（一）细菌室的符合条件细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面1m处，每天开始工作前照射20min。对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。二、细菌的分离培养室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗1次。（一）细菌室的符合条件二、细菌的分离培养对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开井放在指定位置。同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。细菌室应有当地的气温特点的消防设备。（一）细菌室的符合条件二、细菌的分离培养（二）无菌实验室（三）基本设备和器具二、细菌的分离培养

培养基的组成成分营养物质：(1)蛋白胨；(2)肉浸液；(3)牛肉膏；(4)糖类；(5)血液；(6)无机盐类；(7)鸡蛋和动物血清；(8)生长因子：提供细菌生长繁殖所需要的氮源和碳源，还有生长因子。凝固物质：制备固体培养基时，加入琼脂，琼脂是半乳糖胶，98℃以上时可溶于水，在45℃以下则凝固成凝胶状态。抑制剂和指示剂：用于选择、鉴定及判断结果。二、细菌的分离培养二、细菌的分离培养方法：用分区划线法在合适培养基上培养意义看培养基中有无细菌生长推断是否为细菌病；依据菌落的特征判断细菌种类；用菌落中的细菌进一步作形态学鉴定；可进一步作生化鉴定、血清学鉴定及动物试验；可进一步作药敏试验；二、细菌的分离培养通常选用适合目标菌生长的平板培养基对细菌进行分离培养。不同细菌的菌落大小、形态、色泽、表面特征、边缘状态、隆起度、透明度等特征不同。有的细菌在鲜血琼脂平板上形成溶血环。也可采用选择培养基或鉴别培养基，以起到抑制杂菌或快速鉴别的效果。比如肠道杆菌科可选择麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂。二、细菌的分离培养分区划线法二、细菌的分离培养伊红美蓝培养基、麦康凯培养基上大肠杆菌菌落不同的培养方法需氧培养法：最常用的培养方法，适于需氧和兼性厌氧菌的培养。二氧化碳培养法：二氧化碳培养箱：是一台特制的培养箱，既能调节C02的含量，又能调节所需的温度。此法适于大型实验室应用。烛缸法：将已接种好的培养基置干燥器内，并放人点燃的蜡烛。干燥器盖的边缘涂亡凡士林，盖上盖子，烛光经几分钟后自行熄灭，此时干燥器内C02含量约占5％-10％，然后将干燥器放入35℃温箱内培养。二、细菌的分离培养化学法：按每升容积加入碳酸氢钠0.4g和浓盐酸0.35ml的比例，分别置于容器内。将容器连同接种好的培养基都放人干燥器内，盖紧干燥器的盖子，倾斜容器使浓盐酸与碳酸氢钠接触生成CO2。(三)厌氧培养法不同的培养方法二、细菌的分离培养三、细菌的生化检测进行生化试验的细菌必须是纯培养物。检验时，根据可疑细菌的生化特性选择特定的一组生化试验，将结果与标准进行对比，以确定病原菌的种类。例：不同种沙门氏菌的生化鉴定三、细菌的生化检测鸡白痢沙门氏菌鸡伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌不同种沙门氏菌的生化鉴定糖(醇、苷)类发酵试验VP试验甲基红试验枸橼酸盐利用试验吲哚试验IMViC试验大肠杆菌产气杆菌三、细菌的生化检测四、细菌的血清学实验临床诊断中，可用于细菌的血清分型、快速诊断或大群检疫。用已知抗体检测动物体内的病原菌用已知的病原菌抗原检测动物血清中的抗体例：鸡白痢的检疫四、细菌的血清学实验1、加一滴抗原2、加一滴鸡的全血3、将抗原和血液混匀4、静置2min,观察结果鸡白痢检疫—